基于aflp技術(shù)的屬4種embraiza基因組dna多態(tài)性分析

基于aflp技術(shù)的屬4種embraiza基因組dna多態(tài)性分析

aflum是vos和其他科學(xué)家發(fā)展的一種新方法，用于檢測dna的多態(tài)性。這是一種由rand和rad有機(jī)結(jié)合而成的、輕復(fù)性和便利性的碳?xì)浠衔铩Ｋ粌H具有rflp的可靠性，而且具有radt的便利性。大量分子標(biāo)記可以經(jīng)濟(jì)、快速、有效地產(chǎn)生，而且具有豐富的遺傳多樣性信息的重復(fù)性和適應(yīng)性。此外，它具有良好的重復(fù)性和可比性，不需要了解測量的dna序列。這為物種遺傳多樣性評估和物種遺傳關(guān)系研究提供了新的分子手段。門內(nèi)子科是屬于雀科科的門內(nèi)子科，主要分布在歐洲、亞洲和北非。其中，26種分布在中國。雖然有關(guān)于鳥類核型和數(shù)量細(xì)胞分類的報(bào)告，但沒有報(bào)告用分子標(biāo)記技術(shù)對鳥類進(jìn)行分類研究和分子表觀研究。選擇四種藥物。使用fil分子標(biāo)記技術(shù)，從39個(gè)引用物種中選擇11個(gè)，對4種的遺傳變化進(jìn)行了擴(kuò)展分析，確定了4種的遺傳差異，并分析了4種的親屬關(guān)系。為生物多樣性分類的應(yīng)用提供了科學(xué)知識。本研究中選擇的四種藥物在中國分布。其中三種被分布在中國中部、西南部和南部，為繁殖鳥類、遺鳥和冬季候選人。頭和白尾鳥主要分布在中國西北部和西北部，白色耳帶主要分布在中國東北部和西伯利亞的附近地區(qū)，以及中國南方。1材料和方法1.1采樣、pcr擴(kuò)增和pcr檢測采集三道眉草鹀、白頭鹀、白眉鹀、灰頭鹀的肝臟組織,采樣數(shù)量及采樣地點(diǎn)見表1,采樣方式為系統(tǒng)隨機(jī)采樣.出于對野生鳥類的保護(hù),每種樣品采樣數(shù)量有限.DNA提取用蛋白酶K購自中國大連TaKaRa,AFLP引物和接頭均由上海生工合成,PCR擴(kuò)增所需藥品試劑均購自上海生工,采用MJResearchPTC-200和BiometraT1型PCR擴(kuò)增儀.1.2aflp分析取肝臟組織約1g,用蛋白酶K消化,酚-氯仿抽提,無水乙醇沉淀法提取基因組DNA后,用超純水稀釋至100mg/L,用于AFLP分析.測定DNA分子量約為50kb,樣品膠孔不發(fā)亮,DNA主帶清晰,無彌散帶,RNA去除干凈,DNA純度較高(圖1),符合AFLP技術(shù)要求.1.3aflp分析1.3.1er、mee酶和ctcg堅(jiān)持的酶切連接法取300ng基因組DNA,用EcoRI和MseI進(jìn)行雙酶切,酶切片段與EcoRI和MseI接頭連接,反應(yīng)體系為20μL∶300ng基因組DNA,2.0μL10×T4ligasebuffer,1μLBSA(10g/L),0.5μLEcoRIadapter(25μmol/L,0.5μLMseIadapter(5μmol/L),2UEcoRI酶,2UMseI酶,1UT4ligase,加超純水至20μL.酶切連接時(shí)間為8h.EcoRI接頭序列為5′?CTCGTAGACTGCGTACCCATCTGACGCATGGTTAA?5′；5′-CΤCGΤAGACΤGCGΤACCCAΤCΤGACGCAΤGGΤΤAA-5′；MseI接頭序列為5′?GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT?5′.5′-GACGAΤGAGΤCCΤGAGΤACΤCAGGACΤCAΤ-5′.1.3.2pcr擴(kuò)增條件采用3′端帶1個(gè)選擇性堿基的引物組(EcoRI+A/MseI+C)預(yù)擴(kuò)增限制性片段,反應(yīng)體系為25μL:2μL連接產(chǎn)物,2.5μL10×PCRbuffer,1μLdNTP(2.5mmol/L),1μLEcoRI+A(30mg/L),1μLMseI+C(30mg/L),1UTaq酶,加超純水至25μL.PCR反應(yīng)條件為94℃45s,56℃30s,72℃80s,共29個(gè)循環(huán);72℃延伸10min.EcoRI+A的引物序列為:5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′;MseI+C的引物序列為:5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′.選擇性擴(kuò)增引物帶有3個(gè)選擇性堿基,從39對引物中篩選出11對條帶清晰多態(tài)性好的引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增(表2).選擇性擴(kuò)增的反應(yīng)體系為15μL:1∶20倍稀釋的預(yù)擴(kuò)增限制性片段產(chǎn)物2μL,0.5μLdNTP(2.5mmol/L),1.5μL10×PCRbuffer,0.5μLEcoRI(5mg/L),0.5μLMseI(30mg/L),0.5UTaq酶,加超純水至15μL.PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性30s;94℃30s,65℃30s,72℃80s,每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.7℃;12個(gè)循環(huán)以后,再進(jìn)行24個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增,條件為94℃30s,56℃30s,72℃80s;72℃延伸10min.1.3.3aflp電泳取15μL選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物,加7μL3×上樣緩沖液,上樣于4%～6%的聚丙烯酰胺變性膠上進(jìn)行電泳,緩沖液為1×TBE,電泳條件為:55W的恒定功率,電泳3.0h.用銀染方法顯示AFLP譜帶.1.4jac鞣份的信息網(wǎng)絡(luò)ntsyspc-2.10e每條擴(kuò)增帶即為一個(gè)分子標(biāo)記,每兩個(gè)樣品間的標(biāo)記進(jìn)行成對比較,在同一位點(diǎn),當(dāng)AFLP譜帶存在時(shí)賦值為1,不存在時(shí)賦值為0,只統(tǒng)計(jì)清晰易辨的擴(kuò)增帶,將整個(gè)分子標(biāo)記圖譜轉(zhuǎn)化成“1”,“0”信息矩陣.利用NTSYSpc-2.10e軟件提供的Jaccard系數(shù)估計(jì)不同物種間的相似性系數(shù),公式為:JSI=Nab/(Na+Nb-Nab),式中Nab為兩個(gè)個(gè)體的共同條帶數(shù),Na和Nb分別為個(gè)體A和個(gè)體B的條帶數(shù).根據(jù)Jaccard相似性系數(shù)的原理,當(dāng)JSI為0.00～0.25時(shí),為極不相似;JSI為0.25～0.50時(shí),為中等不相似;JSI為0.50～0.75時(shí)為中等相似;JSI為0.75～1.00時(shí)為極相似.2結(jié)果2.1擴(kuò)增織物的多態(tài)性本實(shí)驗(yàn)使用了11對引物,共擴(kuò)增了535條帶,其中多態(tài)條帶429條,平均每對引物產(chǎn)生39條多態(tài)條帶,變化范圍為21～66條(表2).大多數(shù)的多態(tài)條帶都聚集在200～700bp左右.圖2為E-ACC/M-CTA引物組合擴(kuò)增的AFLP指紋圖譜,其中箭頭所示為物種特異性條帶.2.2白發(fā)育程度的相似性根據(jù)11對引物的擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算4種鹀之間的遺傳相似性系數(shù),結(jié)果列于表3.由表3可見,三道眉草鹀與白頭鹀的相似性系數(shù)為0.5029～0.5286;三道眉草鹀與白眉鹀的相似性系數(shù)為0.3554～0.3712;三道眉草鹀與灰頭鹀的相似性系數(shù)為0.3715～0.3994;白頭鹀與白眉鹀的相似性系數(shù)為0.4052～0.4381;白頭鹀與灰頭鹀的相似性系數(shù)為0.4150～0.4532;白眉鹀與灰頭鹀的相似性系數(shù)為0.6851～0.7402.根據(jù)相似性系數(shù)可以得出4種鹀中白眉鹀與灰頭鹀親緣關(guān)系最近,三道眉草鹀與白眉鹀親緣關(guān)系最遠(yuǎn).2.34樹狀分子系統(tǒng)進(jìn)化圖采用NTSYSpc-2.10e中的SAHN程序和UPGMA方法進(jìn)行聚類分析并繪制樹狀分子系統(tǒng)進(jìn)化圖(圖3),計(jì)算了CopheneticValues用其結(jié)果與Jaccard相似性結(jié)果進(jìn)行Mental檢測,結(jié)果r=0.99556,為顯著相關(guān),證明樹狀圖有很高的可信性.3討論3.1aflp技術(shù)的應(yīng)用一次AFLP分析一般可獲得50～100個(gè)分子標(biāo)記,一種酶切組合可利用的選擇性引物組合多達(dá)4096種,由此可產(chǎn)生200000～400000個(gè)DNA標(biāo)記,即使僅有10%的標(biāo)記為多態(tài)標(biāo)記,也可獲得20000～40000個(gè)多態(tài)標(biāo)記.因此,AFLP技術(shù)是快速、高效而廉價(jià)的物種基因組掃描的方法,這些優(yōu)點(diǎn)使它成為物種鑒定和保護(hù)的有力手段,Vos等申請AFLP專利的關(guān)鍵就在于此.AFLP分子標(biāo)記可以為雞的連鎖圖構(gòu)建提供一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效的方法.同樣也可適用于其他鳥類基因組的DNA研究.本實(shí)驗(yàn)中利用11對引物組合共檢測到429條多態(tài)標(biāo)記,平均每對引物組合能檢測到39條多態(tài)標(biāo)記,可見AFLP分析確具有很高的多態(tài)檢測率.此外,本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了部分引物組合能擴(kuò)增出某種鹀的DNA特異條帶(圖2),多次重復(fù)均能得到同樣的結(jié)果,一旦這些條帶被確定為某種鹀所特有,對于鑒別這類鹀種資源和鹀屬分類學(xué)研究都將具有重要的意義.3.24基于aflp技術(shù)的聚類分析和系統(tǒng)發(fā)育樹本實(shí)驗(yàn)采用AFLP技術(shù)分析4種受測鹀的親緣關(guān)系.AFLP技術(shù)可以從整個(gè)基因組范圍內(nèi)檢測DNA多態(tài)性.此種分析方法可以通過比較不同物種的AFLP多態(tài)標(biāo)記共享度,較全面地反映各物種之間的DNA序列的同源程度,進(jìn)而更真實(shí)地體現(xiàn)各物種間的親源關(guān)系,為物種的系統(tǒng)分類提供有力的分子生物學(xué)依據(jù).通過對AFLP數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,我們將4種鹀分為4組,每種鹀所選的不同個(gè)體分別聚為一組,其中三道眉草鹀與白頭鹀、白眉鹀與灰頭鹀分別相聚為一大組,這與張?jiān)热烁鶕?jù)數(shù)量細(xì)胞進(jìn)行的分類研究基本一致,其中的差異可能是