代謝組學(xué)研究進(jìn)展

代謝組學(xué)研究進(jìn)展

1在生物標(biāo)記物中的應(yīng)用代謝組學(xué)是一種新的基礎(chǔ)研究概念、遺傳因素組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)。在對(duì)特定基因或環(huán)境條件進(jìn)行評(píng)估和干預(yù)后，考慮到生物因素的變化，它是研究生物體所有代謝方法的新技術(shù)。其研究對(duì)象主要是相對(duì)分子質(zhì)量1000以下的內(nèi)源性小分子。與其他組學(xué)相比,它更能真實(shí)反映機(jī)體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài),為正在進(jìn)行的生物過程提供一種瞬時(shí)的、綜合的快照。在英文文獻(xiàn)中,Metabonomics和Metabolomics均指代謝組學(xué),前者一般以生物體液和組織為研究對(duì)象,Nicholson將其定義為定量分析生物體因病理生理刺激或基因改變引起的代謝應(yīng)答變化;后者則側(cè)重以細(xì)胞為研究對(duì)象,Fiehn將其定義為定性、定量分析單個(gè)細(xì)胞或單一類型細(xì)胞株的代謝調(diào)控和代謝流中所有低分子量的代謝產(chǎn)物。在Metabolomics研究中,根據(jù)研究對(duì)象和目的不同,Fiehn首次將代謝組學(xué)劃分為靶向分析、代謝輪廓分析、代謝組學(xué)分析和代謝指紋分析四個(gè)層次。在其研究基礎(chǔ)上,Kell等提出了代謝足跡分析,即細(xì)胞外代謝物分析,進(jìn)一步擴(kuò)大了代謝組學(xué)的研究范圍;隨后,Villas-Boas等又將代謝組學(xué)劃分為靶向分析和代謝輪廓分析兩類,后者包括代謝指紋分析和足跡分析。惡性腫瘤是一種多因素參與造成機(jī)體各系統(tǒng)功能平衡紊亂的復(fù)雜疾病,導(dǎo)致機(jī)體病理生理過程變化,最終引起代謝組的改變。研究表明癌細(xì)胞具有一種獨(dú)特的、有別于正常細(xì)胞的代謝表型,利用代謝組學(xué)技術(shù)在給定的時(shí)間和條件下可監(jiān)測(cè)正常細(xì)胞及癌細(xì)胞代謝過程中所有小分子代謝物的波動(dòng)情況,將有利于預(yù)測(cè)腫瘤的進(jìn)展、了解體內(nèi)物質(zhì)代謝途徑、探索癌癥發(fā)病機(jī)制及藥物作用機(jī)制等,再結(jié)合多種化學(xué)模式識(shí)別方法,從而發(fā)現(xiàn)與特定腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)記物。此外以人癌細(xì)胞為研究對(duì)象還可避免物種差異引起的誤差、降低實(shí)驗(yàn)成本、減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間,有望實(shí)現(xiàn)通過其特征性生物標(biāo)記物進(jìn)行癌癥的早期診斷。本文對(duì)代謝組學(xué)研究中的細(xì)胞樣品前處理方法及細(xì)胞層面的代謝組學(xué)研究進(jìn)展做相應(yīng)的論述。2樣品前處理的必要性代謝組學(xué)主要是對(duì)特定條件下或某一時(shí)刻細(xì)胞內(nèi)代謝物進(jìn)行的分析,因細(xì)胞內(nèi)酶系活躍、代謝轉(zhuǎn)換迅速,取樣和樣品制備方法顯著影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性。因此,做好樣品的前處理是取得可靠分析結(jié)果的先決條件。根據(jù)研究對(duì)象、目的和分析技術(shù)的不同,對(duì)樣品的前處理要求也不一致,不存在一種普適性的方法,樣品處理方法大致分為兩步:細(xì)胞淬滅和代謝物提取。2.1細(xì)胞內(nèi)開代劑的應(yīng)用淬滅也稱為“滅活”,目的是讓細(xì)胞內(nèi)的酶失活,保證代謝物的輪廓“凍結(jié)”。對(duì)于胞內(nèi)代謝物,由于采樣或脫離培養(yǎng)環(huán)境后細(xì)胞內(nèi)代謝狀態(tài)的變化,造成代謝物種類及含量也隨之發(fā)生變化,為了正確反映培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞代謝物的真實(shí)信息,需要立即淬滅細(xì)胞,終止胞內(nèi)反應(yīng)。理想的淬滅技術(shù)應(yīng)在保持細(xì)胞完整性的基礎(chǔ)上確保酶迅速失活。淬滅方法包括液氮冷凍法、酸堿滅活法、快速過濾法、低溫離心法、細(xì)胞刮法、冷甲醇法等。Dettmer等采用低溫離心法及細(xì)胞刮法淬滅多種貼壁哺乳細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫離心可引起細(xì)胞內(nèi)大量代謝物的泄漏,不適于代謝組學(xué)研究,而細(xì)胞刮法較為理想;Lorenz等建立了快速、簡(jiǎn)便的液氮冷凍法,在INS-1細(xì)胞代謝譜的研究中取得了理想效果。Teng等通過17α-炔雌醇引起的乳腺癌細(xì)胞代謝譜變化對(duì)甲醇淬滅法進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果表明該法快速、簡(jiǎn)便,比傳統(tǒng)淬滅法的提取率高50倍。Sellick等以懸浮培養(yǎng)的中國(guó)倉鼠細(xì)胞為對(duì)象,考察了60%冷甲醇(-40℃)、60%甲醇-70mmol·L-1羥乙基哌嗪乙硫磺酸(pH7.4)、60%甲醇-0.85%碳酸氫銨(pH7.4)、60%甲醇-0.85%NaCl的淬滅效果,并采用多種分析方法測(cè)定了培養(yǎng)液、細(xì)胞提取液及清洗液中的多種組分來考察代謝物泄漏程度,結(jié)果表明60%甲醇-0.85%碳酸氫銨淬滅法泄漏程度最小。自1974年Weibel報(bào)道了一種能夠在短時(shí)間內(nèi)完成取樣、淬滅和胞內(nèi)代謝物提取的快速取樣技術(shù)以來,該法在懸浮培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也得到了迅速發(fā)展,并已成功應(yīng)用于代謝組學(xué)研究中。Volmer等以懸浮細(xì)胞為研究對(duì)象,對(duì)多種采樣方法進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果表明快速過濾法處理效果較佳,具有快速、高效、重現(xiàn)性好、無偏向性等優(yōu)點(diǎn),并可直接應(yīng)用于大量生物樣品的分析。研究發(fā)現(xiàn),淬滅過程會(huì)導(dǎo)致泄漏即細(xì)胞內(nèi)代謝物的丟失,且泄漏的程度與淬滅時(shí)間、溫度及加入的淬滅試劑量等有關(guān);隨著淬滅劑的加入、淬滅時(shí)間減少、離心速度加快,泄漏程度會(huì)減輕。既然代謝物泄漏在所難免,在進(jìn)行樣品前處理時(shí)應(yīng)盡量將泄漏的影響降到最低,并注意平行操作,快速淬滅后,迅速低溫離心收集樣品。另外,由于受細(xì)胞種類或分析技術(shù)的影響,不同淬滅方法效果可能存在差異,在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)做全面考察,選擇最佳淬滅方法。2.2金融抑制因子及代謝中的金屬酶一旦代謝反應(yīng)通過滅活被停止,代謝產(chǎn)物就需要從細(xì)胞中提取出來。根據(jù)細(xì)胞代謝組學(xué)研究層次不同,提取方法及要求也不同。如在靶標(biāo)分析中,需要采用特定的方法有選擇性地提取出相應(yīng)的組分;而在輪廓分析中,則需盡可能提取出多種代謝物。目前許多研究者以細(xì)胞能量代謝中間產(chǎn)物的量為指標(biāo),對(duì)多種提取方法進(jìn)行了系統(tǒng)考察,但因各細(xì)胞株種類、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基組成及細(xì)胞生理?xiàng)l件等不同,造成代謝物水平差異較大,至今仍沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法,實(shí)際中應(yīng)根據(jù)化合物及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌x擇相應(yīng)的提取方法。一般提取時(shí)應(yīng)遵循以下原則:(1)以適當(dāng)?shù)幕厥章蕪募?xì)胞中提取最大量的代謝產(chǎn)物;(2)代謝物不應(yīng)該遭遇任何理化修飾,將降解控制在最小范圍內(nèi);(3)防止代謝物泄漏;(4)具有非破壞性。目前,在細(xì)胞代謝組學(xué)分析領(lǐng)域提取步驟中,傳統(tǒng)的液-液萃取法應(yīng)用最廣。文獻(xiàn)報(bào)道的萃取劑主要有冷甲醇、熱乙醇、高氯酸或堿、熱甲醇、甲醇-氯仿-水、乙腈等。其中,酸、堿提取法是傳統(tǒng)的代謝物提取方法,通常用于提取對(duì)酸或堿穩(wěn)定的代謝物;高氯酸、三氯乙酸已廣泛用于細(xì)胞內(nèi)極性代謝物(如核苷酸類、磷酸糖類、有機(jī)酸、氨基酸等)的提取,但較低pH會(huì)使某些代謝物穩(wěn)定性降低,如丙酮酸鹽、NAD、NADH等;在核苷酸提取物中研究者通常以氯仿萃取,除去脂溶性成分,以減少在色譜柱中的保留,提高重現(xiàn)性。但酸堿提取法需要中和步驟,代謝物的稀釋引起回收率的降低;另外因代謝物在沉淀上的吸附可能會(huì)影響定量。對(duì)于非極性代謝物的提取,如脂類,通常采用有機(jī)溶劑法,包括氯仿、氯仿-甲醇-水、乙酸乙酯法等,實(shí)驗(yàn)中無鹽加入、提取劑易去除,但采用熱甲醇等提取時(shí),會(huì)引起熱不穩(wěn)定代謝物的降解。到目前為止,以甲醇為代表的有機(jī)溶劑提取法在代謝組學(xué)分析中的應(yīng)用最廣,具有操作簡(jiǎn)便快速、無離子抑制效應(yīng)、pH影響最小、提取物易蒸發(fā)濃縮等優(yōu)點(diǎn)。Dettmer等研究了提取方法對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株代謝譜的影響,對(duì)甲醇、甲醇-水、乙腈、乙腈-水、甲醇-氯仿-水、甲醇-異丙醇-水、酸性甲醇7種提取方法提取的代謝物進(jìn)行對(duì)比分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)80%甲醇提取出的代謝物最多。在代謝輪廓及指紋分析中,通常采用多相提取劑,以實(shí)現(xiàn)對(duì)水溶性、脂溶性成分的高通量分析。此外,有研究者采用淬滅-萃取一步法,即將淬滅劑(也稱萃取劑)直接加入培養(yǎng)瓶中破碎細(xì)胞,同時(shí)提取代謝物。Teng等以冷甲醇(-20℃)淬滅-提取出人乳腺癌細(xì)胞中的代謝物。Bennett等以人纖維母細(xì)胞為研究對(duì)象,將80%冷甲醇直接加入棄去培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,取得較好的提取效果。Sellick等采用60%甲醇-0.85%碳酸氫銨緩沖液(pH7.4,-40℃)淬滅中國(guó)倉鼠細(xì)胞,考察了甲醇及其水溶液、熱乙醇(90℃)、高氯酸及甲醇-氯仿對(duì)細(xì)胞代謝物的提取效果,以GC-MS法鑒定出的代謝物數(shù)目為指標(biāo),結(jié)果表明采用甲醇、水依次進(jìn)行萃取效果最佳,共鑒定出89種代謝物。Hofmann等先以熱空氣(150℃×5s)處理HepG-2人肝癌細(xì)胞,再加入沸水1.5mL,淬滅及提取同步進(jìn)行。不僅縮短了淬滅時(shí)間,還減少了代謝物的泄漏;但不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)中需采用特定參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,研究中不常用。而在代謝足跡分析中,一般向培養(yǎng)液中加入蛋白沉淀劑(如三氯乙酸、乙腈等),離心后直接進(jìn)樣或中和后進(jìn)行分析。除了上述提到的液-液萃取之外,超臨界流體萃取、固相萃取、固相微萃取、微波輔助萃取等方法以提取效率高、溶劑消耗低、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)在代謝物提取領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用前景。3核苷酸及糖代謝代謝靶向分析是針對(duì)某個(gè)或某幾個(gè)特定組分的定量分析。因其焦點(diǎn)為特定化合物的分析,通常忽略其他大量的代謝組信息,故需要采用具有選擇性的樣品制備技術(shù)除去干擾物,或選擇一定的數(shù)據(jù)預(yù)處理技術(shù)去除干擾物色譜峰,優(yōu)化數(shù)據(jù)質(zhì)量,提高方法靈敏度和代謝物濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性。但當(dāng)目標(biāo)物處于重疊色譜峰中時(shí),需借助專門的化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)進(jìn)行解析,如平行因子分析法、多元曲線分辨-交互最小二乘法(MCR-ALS)等。目前,該研究主要集中于與癌細(xì)胞能量代謝相關(guān)的化合物研究,如核苷類、氨基酸類、脂類、糖類等。腫瘤的發(fā)生發(fā)展伴隨著基因的變化,而核苷酸為RNA及DNA生物合成的前體物質(zhì),同時(shí)也參與了體內(nèi)大多數(shù)生化反應(yīng)(如脂肪酸、糖代謝等),在癌癥變化過程中其代謝過程及含量也必然會(huì)受到一定的影響。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤患者與正常人相比,機(jī)體內(nèi)核苷酸類代謝物含量發(fā)生了顯著改變。Huang等采用HPLC法測(cè)定正常細(xì)胞及8種癌細(xì)胞中的核苷酸,發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞之間的三磷酸核苷及脫氧三磷酸核苷含量不同;Jia等建立了人肝癌細(xì)胞HepG-2中核苷酸類物質(zhì)的分析方法,并對(duì)其代謝物變化進(jìn)行了初步研究;Lehtimaki等研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡過程中核苷酸水平增高,Williams和Anthony等發(fā)現(xiàn)CDP-膽堿在其凋亡期間水平也增高;Wang等研究小組以多孔石墨碳為固定相、LC-MS法對(duì)HepG-2細(xì)胞中一磷酸腺苷進(jìn)行定量分析,該研究對(duì)了解化療后癌細(xì)胞死亡過程中的能量狀態(tài)奠定了基礎(chǔ)。氨基酸及生物胺類組分也在生物系統(tǒng)中扮演著多種作用,如組成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元、生物信息傳遞、細(xì)胞增殖、能量代謝等,是各種腫瘤的重要標(biāo)記物。研究表明精氨酸、牛磺酸、蘇氨酸、γ-氨基丁酸、纈氨酸、甘氨酸等為癌細(xì)胞特有的標(biāo)記物。陸偉等研究發(fā)現(xiàn)蘇氨酸、牛磺酸為肝癌細(xì)胞增殖所必需;Kao等采用毛細(xì)管電泳法分析了乳腺癌細(xì)胞中9種氨基酸,正常乳腺上皮細(xì)胞中10種氨基酸,結(jié)果在癌細(xì)胞中牛磺酸含量升高、谷氨酰胺及谷氨酸等減少,該研究在應(yīng)用不平衡氨基酸治療癌癥方面可能具有重要意義。Ippolito等在利用MRS研究前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌衍生的前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)了與能量代謝密切相關(guān)的小分子代謝物γ-氨基丁酸及丙二醇,二者在癌細(xì)胞中的含量明顯增高,與細(xì)胞能量利用、細(xì)胞增殖及細(xì)胞之間信息傳遞等密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在各類惡性腫瘤、炎癥時(shí)脂類代謝物濃度和定位都會(huì)發(fā)生變化。目前已發(fā)現(xiàn)多種與腫瘤相關(guān)的脂類標(biāo)記物,例如膽堿、磷酸膽堿、磷酸卵磷脂、膽固醇等變化譜是細(xì)胞膜破壞的標(biāo)志,這些變化表明細(xì)胞正在經(jīng)受各種因素刺激而導(dǎo)致凋亡的過程。目前在各種類型癌癥中已發(fā)現(xiàn)其水平的變化,如腦腫瘤、肉瘤、肝癌、前列腺癌等。此外在細(xì)胞凋亡期間,膠質(zhì)瘤及去分化的多形態(tài)脂肪瘤中多不飽和脂肪酸的含量增加。同樣,腫瘤對(duì)糖的代謝也有影響。1920年,德國(guó)生物化學(xué)專家Warburg首次報(bào)道腫瘤細(xì)胞的糖酵解活性較正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步研究表明,即使在氧氣充足條件下,這種現(xiàn)象同樣存在,被稱為“Warburg效應(yīng)”。目前已發(fā)現(xiàn)多種與糖代謝相關(guān)的生物標(biāo)記物,如丙酮酸、乳酸、異丁酸等。近年來,探索通過靶向糖酵解代謝途徑治療惡性腫瘤的策略正備受關(guān)注。4細(xì)胞代謝的表征代謝輪廓分析是對(duì)預(yù)設(shè)的一些代謝產(chǎn)物的定量分析,如某一結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相似的化合物、預(yù)先選擇的某些代謝途徑的所有中間產(chǎn)物、多條代謝途徑中的標(biāo)志性組分等,是對(duì)大范圍內(nèi)的代謝物進(jìn)行檢測(cè),目的是獲得一套完整的、綜合的代謝組輪廓,以便更直觀地理解參與代謝的化合物之間以及所有酶之間的相互作用,是對(duì)細(xì)胞代謝的抽象表達(dá)。目前,采用基于NMR法的代謝輪廓分析已尋找出多種與能量代謝相關(guān)的標(biāo)記物,主要涉及到糖酵解、三羧酸循環(huán)、膽堿和脂肪酸代謝等,在癌癥診斷和治療方面扮演著重要角色。此外,國(guó)內(nèi)外許多研究者對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的代謝輪廓與細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究,但細(xì)胞內(nèi)的代謝組不是靜態(tài)的,不同個(gè)體對(duì)外界擾動(dòng)所作出的響應(yīng)也存在較大的差異,使得代謝物的準(zhǔn)確測(cè)定及其與疾病的相關(guān)性研究仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。Bullinger和Chen等研究了MDA-MB-435,MCF-7及MCF-10A細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞中心代謝(包括糖酵解、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)、甲羥戊酸途徑、脂肪酸和氨基酸的生物合成途徑等)中大量的關(guān)鍵性化合物,同時(shí)對(duì)各種代謝途徑的通量進(jìn)行了評(píng)價(jià);結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的外界擾動(dòng)及在細(xì)胞周期中,各細(xì)胞的特定代謝輪廓具有明顯差異。從以上兩方面的概述可以看出,靶標(biāo)分析與代謝輪廓之間的差異較小,二者之間的差異主要由所測(cè)代謝物的數(shù)量和所得數(shù)據(jù)質(zhì)量來決定。5細(xì)胞代謝特性代謝組學(xué)分析是采用高通量的分析技術(shù)對(duì)限定條件下的特定生物樣品中代謝組分的定性和定量,即整體性地分析生物體對(duì)內(nèi)外因素做出動(dòng)態(tài)應(yīng)答的所有代謝物小分子。生物體在受到外源性干擾后,其所處的內(nèi)環(huán)境也相應(yīng)的發(fā)生改變,原本正常的代謝狀態(tài)也隨之發(fā)生變化。在細(xì)胞研究的層面上,其研究的是細(xì)胞受到外界擾動(dòng)后胞內(nèi)所有代謝物的綜合表現(xiàn)——全局觀點(diǎn),通常采用現(xiàn)代分析方法、計(jì)算機(jī)技術(shù)及統(tǒng)計(jì)方法,以高通量實(shí)驗(yàn)和大規(guī)模的計(jì)算為特點(diǎn),尋找生物體應(yīng)激前后代謝差異,進(jìn)而確定與疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物。Bugrim指出根據(jù)新近發(fā)展的系統(tǒng)生物學(xué)的概念,任何預(yù)測(cè)藥物吸收、分布、代謝、排泄以及毒性評(píng)價(jià)成功的技術(shù)都需要關(guān)聯(lián)內(nèi)源性物質(zhì)代謝變化來考慮藥物的代謝情況,因此通過代謝組學(xué)技術(shù)不僅可研究藥物本身的代謝,還可研究藥物及其他外界刺激引起的內(nèi)源性代謝組的變化,更能直接地反映體內(nèi)生化過程,闡明藥物靶點(diǎn)或作用機(jī)制。此外該技術(shù)為從分子水平上對(duì)細(xì)胞種屬進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)提供了可能,栗暉等利用UPLC-TOFMS和MarkerLynx技術(shù)研究了5種不同來源的細(xì)胞內(nèi)代謝物,采用PCA和PLS法對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并鑒定出10種可能的潛在生物標(biāo)記物,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞種屬之間的分類。癌細(xì)胞具有旺盛的代謝狀態(tài),而癌癥的發(fā)生、發(fā)展亦離不開細(xì)胞周圍的微環(huán)境。腫瘤生長(zhǎng)所依賴的微環(huán)境主要包括葡萄糖、氧分及其他營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)因子,并呈現(xiàn)出明顯的酸性,而乳酸鹽等一些小分子物質(zhì)是構(gòu)成這種酸性環(huán)境的主要成分,因此乳酸鹽含量增加也預(yù)示著癌癥的發(fā)生。目前,國(guó)內(nèi)外許多研究者考察了多種外界擾動(dòng)(如低氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、藥物等)對(duì)細(xì)胞代謝的動(dòng)態(tài)變化、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及代謝關(guān)鍵酶活性等的影響。分別介紹如下。低氧環(huán)境在惡性腫瘤,尤其是一些實(shí)體瘤中很常見,當(dāng)腫瘤體積達(dá)到一定大小時(shí),氧氣便很難透過。在該情況下,即便線粒體功能正常,細(xì)胞的有氧呼吸也會(huì)因缺氧而被抑制,而癌細(xì)胞在增殖過程中卻能很好的適應(yīng)這種狀態(tài),其主要是基于癌細(xì)胞在缺氧或低氧狀態(tài)下的糖酵解能力增強(qiáng),把葡萄糖作為能量的源泉。通過研究缺氧條件下細(xì)胞代謝通路及特定標(biāo)記物,將有助于探明和發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞特有的代謝機(jī)制。Weljie等采用基于1HNMR的代謝組學(xué)法考察了缺氧(1%O2)對(duì)體內(nèi)、外乳腺癌細(xì)胞的影響,并比較分析了缺氧和常氧狀態(tài)下細(xì)胞的代謝情況,利用正交-偏最小二乘法判別分析鑒定了缺氧條件下的一系列標(biāo)記物(如丙酮酸鹽、乳酸鹽、1-甲基組氨酸等)。施冬云等以人肝癌SMMC-7721細(xì)胞和正常肝L02細(xì)胞為研究對(duì)象,在單純?nèi)毖鯒l件下觀察細(xì)胞生長(zhǎng),并檢測(cè)糖代謝關(guān)鍵酶(如丙酮酸激酶、己糖激酶等)的活性,得出癌細(xì)胞較正常細(xì)胞具有更強(qiáng)的缺氧耐受性。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)癌細(xì)胞代謝的影響在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域應(yīng)用較多,如優(yōu)化和控制細(xì)胞培養(yǎng)過程,以避免環(huán)境對(duì)細(xì)胞的不利影響。影響細(xì)胞代謝的環(huán)境因素很多,如葡萄糖、氨基酸、血清、代謝副產(chǎn)物、pH、細(xì)胞密度、滲透壓等。體外培養(yǎng)細(xì)胞的代謝與在體細(xì)胞不同,前者可獲得細(xì)胞代謝行為與環(huán)境之間的關(guān)系,深入對(duì)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的了解。如培養(yǎng)液中葡萄糖濃度較低時(shí),細(xì)胞能量供應(yīng)不足,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受阻、代謝通路改變等。Hartmann等以結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞為分析對(duì)象,評(píng)價(jià)了無血清培養(yǎng)基、血清替代品、血清減少培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞代謝的影響,并利用SPME-GC-MS技術(shù)考察了三種培養(yǎng)條件下細(xì)胞揮發(fā)性代謝組方面的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在各培養(yǎng)基中的形態(tài)和揮發(fā)性代謝組均有顯著性差異。有生物活性的藥物作用于生物體后,會(huì)對(duì)生物體代謝酶的表達(dá)、代謝產(chǎn)物組成及其相對(duì)濃度等產(chǎn)生顯著的影響。目前,許多研究者利用該研究手段考察了多種抗癌劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝等方面的影響,其中以抗代謝類藥物為主(如5-FU、吉西他濱、GTI-2040、羥基脲)[43,44,45,46,47,48],此外還有鉑類(如順鉑)、烷化劑、抗生素、植物藥及海洋天然產(chǎn)物等。一般將癌細(xì)胞株置于不同濃度的藥物中,或在不同時(shí)間內(nèi)用藥物處理細(xì)胞,以考察細(xì)胞受到藥物抑制作用后所產(chǎn)生的代謝物動(dòng)態(tài)變化,為理解化療中細(xì)胞凋亡或增生機(jī)制、藥物篩選、毒理學(xué)機(jī)制、藥效機(jī)制等奠定了基礎(chǔ)。Griffin等將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株暴露于不同濃度的他莫西芬中,應(yīng)用梯度MAS-NMR技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞代謝物檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的升高,乙醇胺、葡萄糖、谷氨酸、酪氨酸、腺苷等濃度也隨之升高。Cohen等、VanMoorsel等分別以白血病細(xì)胞株、21種實(shí)體瘤細(xì)胞為對(duì)象,考察吉西他濱對(duì)核苷酸庫的影響:前者發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞中dNTP庫減少,而耐藥細(xì)胞株中dNTP庫無顯著性變化,后者發(fā)現(xiàn)NTP庫與細(xì)胞-藥物之間的敏感性無關(guān),給藥后不同細(xì)胞內(nèi)NTP庫變化不盡相同。6代謝足跡分析研究表明,生物體在生長(zhǎng)過程中會(huì)分泌大量代謝物,特別在不平衡生長(zhǎng)條件下,能分泌許多具有生理活性的初級(jí)和次級(jí)代謝物以及信號(hào)分子,這種分泌過程能清晰地反映細(xì)胞的代謝活動(dòng)以及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,即細(xì)胞外代謝組學(xué)。該分析技術(shù)已成功應(yīng)用于代謝組學(xué)研究中,是由英國(guó)科學(xué)家Kell等在2003年首先設(shè)計(jì)出的一種用于代謝組學(xué)細(xì)胞功能分析的新技術(shù),其采用直接注射質(zhì)譜技術(shù),以細(xì)胞培養(yǎng)液為分析對(duì)象,監(jiān)控細(xì)胞從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中消耗營(yíng)養(yǎng)物以及分泌代謝物質(zhì)培養(yǎng)基的全部過程。Kell將其定義為細(xì)胞外代謝組學(xué),Nielsen和Oliver等引入Endo-Metabolome和Exo-Metabolome術(shù)語以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)、外代謝物。該分析技術(shù)可與細(xì)胞內(nèi)代謝組研究相互補(bǔ)充,為進(jìn)一步完善代謝組學(xué)的研究范圍打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。代謝足跡分析與前述細(xì)胞內(nèi)代謝物的分析不同,具有以下特點(diǎn):(1)樣品制備過程簡(jiǎn)便,無需淬滅及提取步驟;因細(xì)胞內(nèi)代謝物是動(dòng)態(tài)的,且大多數(shù)代謝物的轉(zhuǎn)換速度極快,從幾秒鐘至幾分鐘,故需快速淬滅細(xì)胞以凍結(jié)新陳代謝,再采用一定的方法提取代謝物,上述實(shí)驗(yàn)均增加了操作上的困難,很可能造成對(duì)代謝通量的誤解;(2)胞內(nèi)某些生化反應(yīng)與胞外基質(zhì)相關(guān),如復(fù)雜基質(zhì)的降解反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控等,只能通過細(xì)胞外降解產(chǎn)物的測(cè)定來評(píng)價(jià);(3)便于考察細(xì)胞對(duì)外界物質(zhì)的利用情況,優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。Pansikanti