疏肝健脾方藥含藥血清對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞lr4p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響

疏肝健脾方藥含藥血清對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞lr4p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響

非酒精肝臟疾?。╪ad）已成為世界公共衛(wèi)生問(wèn)題。世界發(fā)病率約為5%25%，中國(guó)約為15%。大多數(shù)nad患者仍處于簡(jiǎn)單的脂肪變化階段，呈現(xiàn)良好或無(wú)意的非珠鹽治療過(guò)程，約3%5%的患者將進(jìn)入低脂肪性肝炎（nash）。NASH與最終的纖維化,肝硬化和肝癌等終末期肝病密切相關(guān)。因此,NASH被認(rèn)為在NAFLD的疾病演變進(jìn)程中的重要階段。NASH作為一種炎癥性疾病,炎癥在NASH中扮演了關(guān)鍵性的角色,炎癥可以導(dǎo)致胞外基質(zhì)和纖維化在肝臟中沉積。促炎細(xì)胞因子的釋放及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在NASH的發(fā)展中起重要的作用,并且這些炎癥反應(yīng)不僅來(lái)自肝臟,還來(lái)自腸道內(nèi)毒素和脂肪沉積。而肝細(xì)胞就是NASH重要的組織炎癥來(lái)源之一。本課題組前期體內(nèi)試驗(yàn)表明:NASH大鼠肝細(xì)胞TLR4/p38MAPK信號(hào)通路能夠上調(diào)炎癥介質(zhì)IL-6,TNF-α表達(dá),導(dǎo)致肝組織炎癥損傷,肝功能受損。而疏肝健脾方藥能夠調(diào)控TLR4/p38MAPK信號(hào)通路,下調(diào)炎癥介質(zhì)IL-6,TNF-α表達(dá),減輕肝細(xì)胞炎癥損傷,但其具體作用途徑有待于進(jìn)一步明確。NASH在體研究日益深入之際,體外研究也廣泛開(kāi)展起來(lái),國(guó)外有大量報(bào)道成功應(yīng)用原代細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)闡釋NAFLD/NASH發(fā)病的分子機(jī)制。國(guó)內(nèi)亦有應(yīng)用革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分LPS與其受體結(jié)合后,通過(guò)多種途徑導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥損傷用于NASH離體研究。這些為體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒?為研究NASH肝細(xì)胞損傷機(jī)制體外試驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。本次研究在建立LPS刺激下大鼠肝細(xì)胞炎癥損傷細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,針對(duì)中藥復(fù)方成分復(fù)雜多樣的特點(diǎn),運(yùn)用可信度、科學(xué)性、可行性都較以往應(yīng)用中藥粗制劑直接體外給藥更高的血清藥理學(xué)方法。觀察疏肝健脾含藥血清通過(guò)TLR4/p38MAPK信號(hào)通路對(duì)LPS刺激下大鼠肝細(xì)胞炎癥損傷體外模型的影響的研究,通過(guò)結(jié)合體外試驗(yàn)及血清藥理學(xué)2種方法,進(jìn)一步探討疏肝健脾方藥防治NASH的藥物作用途徑及機(jī)制。1材料表面1.1syxk粵SPF級(jí)SD大鼠30只,體重(200±20)g,雌雄各半,暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心提供,動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(粵)2012-0117。1.2參茯苓白術(shù)散方疏肝健脾方藥為柴胡疏肝散和參苓白術(shù)散的合方,柴胡疏肝散藥物:柴胡6g,白芍5g,枳殼5g,川芎5g,陳皮6g,香附5g,炙甘草3g。參苓白術(shù)散藥物:人參15g,茯苓15g,白術(shù)15g,白扁豆12g,蓮子9g,山藥15g,砂仁6g,薏苡仁9g,桔梗6g,炙甘草9g。以上藥物均為深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供的中藥配方顆粒劑,購(gòu)自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房,方劑組成和藥物劑量均參考《方劑學(xué)》。1.3試劑、試劑盒IV型膠原酶(美國(guó)Gbico公司);胎牛血清(德國(guó)Hyclone公司);RabbitpolyclonaltoCK18,RabbitpolyclonaltoED1,GoatantiRabbitIgG(H+L),FITCconjugated(鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司);LPS,SB239063(美國(guó)Sigma公司);IL-6,TNF-αELISA試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司);Anti-p38MAPK,Anti-phospho-p38MAPK(美國(guó)CST公司);Anti-TLR4(英國(guó)Abcam公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)ThermoScientific公司);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)ThermoScientific公司);Mini-subCELLgT電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。2方法2.1含藥血清的給藥劑量大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組,每組10只,分為正常組、疏肝健脾方藥組(用于含藥血清)、肝細(xì)胞提取組。根據(jù)李儀奎等提出的制備含藥血清的給藥方法,按給藥劑量=在體實(shí)驗(yàn)的給藥劑量×反應(yīng)系統(tǒng)中被稀釋的倍數(shù),在體實(shí)驗(yàn)的給藥劑量根據(jù)本課題組前期的研究中采用的合方組劑量為11.9g·kg-1,在下一步的細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)中將加入20%的血清,因此采取在體實(shí)驗(yàn)的5倍劑量,故給藥劑量=11.9g·kg-1×5=59.5g·kg-1;正常組給予等體積生理鹽水。2.2灌胃給藥、去血大鼠均飼養(yǎng)于暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室,開(kāi)始給藥前先自適應(yīng)常規(guī)喂養(yǎng)7d。第8天起運(yùn)用李儀奎等提出的血清藥理實(shí)驗(yàn)通法方案開(kāi)始灌胃給藥,每天2次,12h1次,連續(xù)3d。末次給藥后行腹主動(dòng)脈采血,每只約8~10mL血液,以3000r·min-1離心15min分離出血清,對(duì)分離好的血清行熱滅活處理。最后用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌,冰凍保存?zhèn)溆谩?.3細(xì)胞篩網(wǎng)率在前期細(xì)胞分離與鑒定的基礎(chǔ)上加以改進(jìn),以1640培養(yǎng)基10mL,在無(wú)菌培養(yǎng)皿中,使細(xì)胞懸液流出,剪碎未完全消化的肝組織。細(xì)胞懸液分別經(jīng)200目及300目細(xì)胞篩網(wǎng),GBSS液垂懸,50×g3min×2次,4℃離心。離心沉淀物加GBSS液垂懸,50×g3min×2次,4℃離心洗滌,10%1640培養(yǎng)基垂懸所得沉淀,取懸液9∶1染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞終濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL,此即為分離所獲肝細(xì)胞,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.4疏肝健脾含藥血清、p2p8mak信號(hào)通路阻斷劑的篩選用LPS(40mg·L-1)刺激在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞,并分別用20%的疏肝健脾含藥血清、p38MAPK信號(hào)通路阻斷劑SB239063(2mg·L-1)予以干預(yù),用空白血清組(20%空白血清)予以對(duì)照。2.5肝的形態(tài)、狀態(tài)和評(píng)價(jià)在行Typanblue染色后,用倒置相差顯微鏡在細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),并觀察各組細(xì)胞狀態(tài),通過(guò)免疫熒光對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行鑒定。2.6dmem/fps2基因文庫(kù)制備當(dāng)大鼠肝細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上貼壁生長(zhǎng),狀態(tài)良好,每孔細(xì)胞數(shù)量不少于1×104個(gè)時(shí),加入不含血清的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基,然后再按各組藥物干預(yù)方案添加藥物至目標(biāo)濃度后,放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,吸取細(xì)胞上清,保存?zhèn)溆?。用ELISA檢測(cè)肝組織勻漿上清液中TNF-α,IL-6的質(zhì)量濃度,具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2.7蛋白、肝胰腺組織中mmoll-1的檢測(cè)取適當(dāng)量的裂解液,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride,PMSF),使PMSF的最終濃度為1mmol·L-1。計(jì)數(shù)新鮮分離的細(xì)胞,按照5×106~10×106個(gè)細(xì)胞加入1mL蛋白質(zhì)裂解液(ightinferiorphrenicarteriesr,RIPA),4℃,1萬(wàn)~1.4萬(wàn)×g離心5~10min,吸盡上清,留下細(xì)胞沉淀備用。根據(jù)碧云天BCA蛋白濃度試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。肝細(xì)胞樣本進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、4℃過(guò)夜。洗滌后加入二抗,孵育,充分洗滌,然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。曝光、顯影、定影,最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行吸光度掃描分析。2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方差分析用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用ue0af±s表示,組間比較使用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析,P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1kupffer細(xì)胞數(shù)量每只大鼠可獲得純化后的肝細(xì)胞數(shù)量為1.5×108~2.0×108個(gè),純化后的Kupffer細(xì)胞數(shù)量為0.5×107~1.0×107個(gè)。吸凈培養(yǎng)基后,用PBS沖洗細(xì)胞2次,用胰蛋白酶消化后行Typanblue染色,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),測(cè)定細(xì)胞活力均在95%以上。3.2貼壁細(xì)胞的形態(tài)剛提取出的大鼠肝細(xì)胞體呈圓球形,色澤透亮,邊界清晰;12h細(xì)胞貼壁后,細(xì)胞呈圓形或橢圓形,色澤更為光亮,體積增大,邊緣伸展,見(jiàn)圖1。對(duì)肝細(xì)胞做CK18免疫熒光鑒定,可見(jiàn)圓球形的肝細(xì)胞呈綠色熒光,肝細(xì)胞呈CK18陽(yáng)性表達(dá),見(jiàn)圖2,說(shuō)明提取的為肝細(xì)胞。3.3兩組小鼠血清中細(xì)胞形態(tài)變化正常組肝細(xì)胞生長(zhǎng)良好,色澤透亮,部分細(xì)胞體積增大,出現(xiàn)分裂增殖,LPS+正常血清組可見(jiàn)部分細(xì)胞脫落,細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡,胞漿顏色變淡,部分細(xì)胞胞核消失,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常,不再呈圓球形或橢圓形,正常血清組、疏肝健脾方組及SB239063組與正常組比較未見(jiàn)明顯差異,見(jiàn)圖3。3.4兩組il-6,tnf-表達(dá)水平比較與正常血清組比較,LPS組肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6,TNF-α水平均有明顯升高(P<0.01),各藥物干預(yù)組肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平大部分均有不同程度的降低,SB239063組、疏肝健脾組與LPS組IL-6,TNF-α表達(dá)水平相比較差異顯著(P<0.01或P<0.05),見(jiàn)表1。3.5對(duì)lp8mak的比較與正常血清組比較,大鼠肝細(xì)胞LPS組p38MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)皆有顯著升高(P<0.05或P<0.01)。在p38MAPK的表達(dá)上,LPS組與正常血清組及正常組比較表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05);與LPS組相比較,SB239063組p38MAPK明顯下降(P<0.01),疏肝健脾組亦有所下調(diào),但無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖4。對(duì)于p-p38MAPK而言,LPS組相比較與正常血清組、正常組明顯上調(diào)(P<0.01),與LPS組對(duì)照,SB239063組、疏肝健脾組下調(diào)均顯著(P<0.01),見(jiàn)圖5。在TLR4的表達(dá)上,LPS組與正常血清組及正常組比較表達(dá)水平有所明顯上調(diào)(P<0.01),疏肝健脾組下調(diào)TLR4的水平具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而SB239063組對(duì)TLR4表達(dá)水平下調(diào)無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖6。4中國(guó)語(yǔ)境下tlr4/3gp8mak基因表達(dá)有研究表明腸源性?xún)?nèi)毒素在單純性脂肪變性向NASH疾病發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用,腸道菌群內(nèi)毒素通過(guò)血液循環(huán)首先就直接導(dǎo)致肝損傷,這也是近年來(lái)NASH腸-肝軸理論形成的基礎(chǔ)。內(nèi)毒素主要包括細(xì)菌LPS,肽聚糖,脂蛋白和各種脂肽,LPS是內(nèi)毒素最重要的組成部分。LPS被證實(shí)能夠通過(guò)增加大鼠肝組織TNF-α,IL-6炎癥介質(zhì)的表達(dá),加重NASH嚴(yán)重程度。而本次體外研究表明:與正常血清組相比較,LPS組TNF-α,IL-6炎癥介質(zhì)表達(dá)增加(P<0.01),而LPS導(dǎo)致肝細(xì)胞TNF-α,IL-6炎癥介質(zhì)表達(dá)增加可能是肝組織TNF-α,IL-6炎癥介質(zhì)的表達(dá)增加,肝臟炎癥損傷的重要組成部分。有研究表明內(nèi)毒素通過(guò)TNF-α,IL-6加重NASH肝損傷程度的假說(shuō),可能與Toll樣受體機(jī)制的作用相關(guān),但其具體機(jī)制尚不清楚。Toll樣受體,作為病原體的傳感器,有助于適應(yīng)性免疫應(yīng)答和炎癥的調(diào)節(jié)和代表腸道菌群的變化,內(nèi)毒素血癥和肝損傷之間的連接,同時(shí)Toll樣受體是固有免疫系統(tǒng)的主要的病原模式受體之一,TLRS通路的激活在嚴(yán)重反應(yīng)中起著重要的作用。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類(lèi)絲/蘇氨酸蛋白激酶,其參與了細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié),并與炎癥及其他多種疾病發(fā)展密切相關(guān)。p38MAPK是MAPKS家族中控制炎癥反應(yīng)最重要的家主成員之一,p38MAPK能夠促進(jìn)白細(xì)胞的聚集和活化,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性和細(xì)胞因子的合成,對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控起著關(guān)鍵性的作用。TLR4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物TLR,也是p38MAPK的上游分子,TLR4/p38MAPK通路上下游之間的關(guān)系,LPS是TLR4的最重要的配體,由LPS與TLR4相結(jié)合,通過(guò)系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),啟動(dòng)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路。在通過(guò)髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)依賴(lài)反應(yīng)通路,激活人腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6,TRAF-6),并與接頭蛋白TAK1激活蛋白因子(TAK1-bindingprotein1TAB1)相結(jié)合,再激活(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-激活性激酶1,TGFβ-activatedkinase1,TAK-1)。TAK-1是TLRS通路和MAPKS的連接紐帶。因此,TLR4最終激活p38MAPK的活化,同時(shí)p38MAPK的活化又與IL-6,TNF-α,IL-10等炎癥因子的表達(dá)密切相關(guān)。本研究表明:LPS組肝細(xì)胞中LPS刺激TLR蛋白表達(dá)增加,激活導(dǎo)致p38MAPK蛋白表達(dá)及磷酸化,較對(duì)照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),且LPS組IL-6,TNF-α炎癥介質(zhì)表達(dá)明顯增加(P<0.01),提示TLR4/p38MAPK信號(hào)通路可能是LPS刺激IL-6,TNF-α炎癥介質(zhì)表達(dá)明顯增加重要通路。古代并無(wú)NAFLD的病名,但當(dāng)代中醫(yī)藥工作者已經(jīng)就NAFLD可以歸屬古代“肝癖、肝著、脅痛”等病達(dá)成專(zhuān)家共識(shí),大樣本臨床流行病學(xué)研究表明當(dāng)今NAFLD的患病人群證候特點(diǎn)主要以肝郁脾虛證、脾虛濕痰證最為常見(jiàn)。本課題組前期的研究