高效液相色譜法同時測定祛痘類化妝品中12種禁限用物質(zhì)

高效液相色譜法同時測定祛痘類化妝品中12種禁限用物質(zhì)

抗癲癇藥物或抗癲癇藥物是目前最難控制的藥物類型之一。這種非法添加抗生素的現(xiàn)象很常見。鑒于濫用抗菌類藥物的嚴(yán)重后果,我國和歐美發(fā)達國家均將抗菌類藥物列入化妝品禁用或限用物質(zhì)名單。有關(guān)高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定祛痘類化妝品中抗菌類藥物的方法已有文獻報道[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16],檢測的各類目標(biāo)成分很多,已發(fā)現(xiàn)的非法添加成分主要有甲硝唑、氯霉素、水楊酸、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等。通過深入研究發(fā)現(xiàn),目前國內(nèi)祛痘類化妝品非法添加的化學(xué)成分主要包括依諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲口惡唑、甲硝唑、替硝唑和水楊酸12種。其中,氯霉素、依諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、磺胺甲口惡唑、甲硝唑、替硝唑等10種成分屬臨床常用抗菌類處方藥,為禁用物質(zhì);水楊酸屬消毒防腐類藥物,《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》2007年版規(guī)定其為限用物質(zhì),明確除香波外不得用于三歲以下兒童使用的產(chǎn)品中,同時標(biāo)簽上必須標(biāo)注“含水楊酸”,但很多添加水楊酸的祛痘類化妝品未按規(guī)定在標(biāo)簽上標(biāo)識。如采用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)體系檢測上述禁限用物質(zhì),至少需要5種以上色譜系統(tǒng),造成監(jiān)管資源的巨大浪費。本文建立了一種同時測定化妝品中上述12種化學(xué)成分的高效液相色譜方法,可滿足化妝品監(jiān)督檢驗的實際工作要求,大大提高了監(jiān)管效能。1實驗部分1.1藥品化學(xué)品來源島津LC20-AT型高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器);超純水器;電子天平。依諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲口惡唑、甲硝唑、替硝唑、水楊酸均來源于中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純,甲醇、磷酸、三乙胺、鹽酸等其他試劑均為分析純。1.2流動相ab色譜柱:ACEC18(250mm×4.6mm,5μm);流速:1.5mL/min;柱溫:40℃;進樣量:20μL;檢測波長:210nm(林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯)和277nm(氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑、水楊酸);流動相:乙腈(A),0.025mol/L磷酸三乙胺溶液(B,取1.54mL磷酸至930mL水中,用三乙胺調(diào)至pH5.5,加入70mL乙腈,混勻),梯度洗脫:0～10min,100%～95%B;10～15min,95%～93%B;15～22min,93%～62%B;22～23min,62%～100%B;23～32min,保持100%B。1.3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取12種標(biāo)準(zhǔn)品適量,用甲醇-0.1mol/L鹽酸混合溶液(體積比1∶1)配制成質(zhì)量濃度約為2500mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。分別精密量取一定體積的氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑、水楊酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用流動相B稀釋配制成5、10、20、40、100、200mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ。分別精密量取一定體積的林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用流動相B稀釋配制成25、50、100、200、500、1000mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ。1.4分析用量準(zhǔn)確稱取樣品約1.0g,置10mL具塞比色管中,加甲醇與0.1mol/L鹽酸混合溶液(體積比1∶1)至刻度,搖勻,超聲提取20min,必要時離心,取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后供分析用。若樣品中待測成分的濃度超出線性范圍的上限,用流動相B為稀釋溶劑進行適當(dāng)稀釋處理。1.5定性分析的方式采用與標(biāo)準(zhǔn)品色譜保留時間和紫外吸收光譜圖比較的方式進行定性分析;取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ和Ⅱ分別進樣,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進行線性回歸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,用外標(biāo)法進行定量分析。2結(jié)果與討論2.1實驗條件的優(yōu)化2.1.1堿土中酸液或堿液從溶解度上分析,氯霉素、氯霉素二醇物、水楊酸微溶于水,易溶于甲醇、乙醇;硝基咪唑類微溶于水和乙醇;喹諾酮類藥物微溶于水和甲醇,易溶于酸溶液或堿溶液;林可霉素類藥物易溶于水或甲醇中;磺胺甲口惡唑在水中幾乎不溶,在稀酸溶液中易溶。用水溶液作為提取溶劑時,氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺類等成分的回收率較低;用純甲醇或乙腈作為提取溶劑時,喹諾酮類成分的回收率較低;比較發(fā)現(xiàn),甲醇-0.1mol/L鹽酸(體積比1∶1)作為提取溶劑時,12種成分的提取效率高,回收率穩(wěn)定。2.1.2紫外吸收特征從12種禁限用物質(zhì)的紫外光譜圖來看,氯霉素、氯霉素二醇物的紫外吸收光譜相似,最大吸收波長在271～277nm左右;依諾沙星、環(huán)丙沙星和氧氟沙星的吸收光譜相似,最大波長在265～295nm;甲硝唑和替硝唑的最大吸收波長均為319nm;磺胺甲口惡唑和水楊酸的最大吸收波長分別為266nm和296nm;林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯無紫外吸收特征,存在末端吸收。綜合考慮后選取277nm作為氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑和水楊酸的檢測波長,選擇210nm作為林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯的檢測波長。2.1.3流動相ph值的影響12種成分中既有酸性化合物和堿性化合物,又有兩性化合物,因此流動相pH值對分離效果的影響較大?？疾炝肆鲃酉鄍H值為4.0～6.0時的色譜行為,隨著pH值增加,氯霉素二醇物、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯的保留時間明顯增加,依諾沙星、環(huán)丙沙星和磺胺甲口惡唑的保留時間明顯減少,甲硝唑、替硝唑、水楊酸和氯霉素的保留時間變化不大。在pH5.5時,各成分的分離效果最好。2.1.4溫度對林分測定總樣的影響分別考察了30、35、40、45℃柱溫條件下12種成分的色譜行為。實驗結(jié)果表明,溫度升高時,林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯的保留時間增加,其他成分的保留時間減少。在40℃時各成分的分離效果最優(yōu)。2.2標(biāo)準(zhǔn)品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別吸取100mg/L和500mg/L的對照品溶液20μL,在波長277nm和210nm分別平行測定6次,氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、水楊酸、氯霉素、依諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑(100mg/L)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.6%、0.04%、0.1%、0.6%、0.03%、0.03%、0.5%、0.04%和0.6%,林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯(500mg/L)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.2%、0.1%和0.5%。分別吸取100mg/L和500mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL,于0、2、4、8、12、24h時進樣,氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、水楊酸、氯霉素、依諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑(100mg/L)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.6%、0.1%、0.3%、1.9%、0.2%、0.2%、0.5%、0.2%和0.5%,林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯(500mg/L)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.2%、0.5%和1.7%。表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.3克林素、克林氧化酶、克林氧化酶磷酸酯2種成分的線性關(guān)系取“1.3”配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述方法測定,線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯3種成分在25～1000mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其他9種成分在5～200mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.997。在霜劑空白樣品中加入一定量的對照品溶液,按S/N=3和S/N=10分別計算儀器檢出限和定量下限,方法的檢出限和定量下限結(jié)果見表1。2.4測定樣品的測定取一批霜劑空白樣品各1g,分別做高、低兩個濃度水平的加標(biāo)回收實驗,平行配制6份,按上述方法進行測定,結(jié)果見表2。12種禁限用物質(zhì)的平均回收率為88%～115%,RSD均小于5%,符合國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《化妝品及其原料中禁限用物質(zhì)檢測方法驗證技術(shù)規(guī)范》要求。2.5非法添加化學(xué)成分在優(yōu)化條件下,標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖見圖1,12種成分的色譜峰分離度均大于2.2,理論塔板數(shù)均大于6650。按上述方法,從商場收集133批化妝品,檢出成分為甲硝唑、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲口惡唑、林可霉素、氧氟沙星、依諾沙星、替硝唑,合格率為91.7%;從網(wǎng)絡(luò)收集228批化妝品,12種成分均有檢出,合格率僅為58.7%。在檢出的12種非法添加化學(xué)成分中,依諾沙星、克林霉素磷酸酯、氯霉素二醇物、替硝唑等為國內(nèi)首次報道。在不合格樣品中,最常見劑型為膏霜劑,檢出頻率最高的成分為林可霉素、氧氟沙星和甲硝唑;混合添加占非法添加樣品的65.1%,最常見添加方式為“硝基咪唑類+林可霉素類+喹諾酮類”。同時混合添加各種藥物引發(fā)的不良反應(yīng)值得關(guān)注。研究還發(fā)現(xiàn)大部分含有氯霉素的化妝品均同時檢出含量較高的氯霉素二醇物,甚至發(fā)現(xiàn)只含氯霉素二醇物不含氯霉素的情況。氯霉素二醇物是合成氯霉素的主要中間體或手