實(shí)驗二 酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞鑒定、霉菌的形態(tài)觀察

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院實(shí)驗課教案首頁課程名稱：微生物實(shí)驗課授課教師姓名：杜曉娜助教授課題目實(shí)驗二真菌的觀察（酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞鑒定、霉菌的形態(tài)觀察）授課對象2011級?？粕锛夹g(shù)班時間分配（1）理論授課部分：實(shí)驗?zāi)康?，?shí)驗原理（10min）；實(shí)驗步驟與操作（15min）；實(shí)驗注意事項（5min）（2）實(shí)驗操作部分：學(xué)生實(shí)驗操作練習(xí)（90min）課時目標(biāo)1.觀察酵母菌的形態(tài)特征、出芽生殖方式2.學(xué)習(xí)鑒別死活細(xì)胞的實(shí)驗方法。3.觀察霉菌的形態(tài)特征授課重點(diǎn)酵母菌和霉菌的形態(tài)及繁殖方式；美藍(lán)染液水浸片鑒定死活細(xì)胞的方法授課難點(diǎn)酵母菌和霉菌的形態(tài)觀察及其繁殖方式授課形式小班授課授課方法板書理論講解、指導(dǎo)學(xué)生實(shí)驗操作練習(xí)參考文獻(xiàn)教材：沈萍，陳向東．微生物實(shí)驗（第四版），高等教育出版社，2007參考文獻(xiàn)：１．沈萍，范秀容，李廣武．微生物學(xué)實(shí)驗（第三版），高等教育出版社，1999２．吳坤，張世敏．微生物學(xué)實(shí)驗技術(shù)，氣象出版社，2004思考題1.描述實(shí)驗結(jié)果，包括觀察到的酵母菌形態(tài)以及死活細(xì)胞鑒定結(jié)果；2.在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區(qū)別于一般細(xì)菌?教研室主任及課程負(fù)責(zé)人簽字教研室主任（簽字）課程負(fù)責(zé)人（簽字）年月日年月日新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗課教案單位:生命科學(xué)技術(shù)系發(fā)酵工程教研室任課教師：杜曉娜基本內(nèi)容教學(xué)手段和時間分配實(shí)驗二真菌的觀察酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒定、霉菌形態(tài)觀察實(shí)驗?zāi)康?.觀察酵母菌的形態(tài)特征、出芽生殖方式2.學(xué)習(xí)鑒別死活細(xì)胞的實(shí)驗方法。3.觀察霉菌的形態(tài)特征4.進(jìn)一步熟悉掌握無菌操作技術(shù)二、實(shí)驗原理

1.酵母菌酵母菌是單細(xì)胞的真核微生物，形態(tài)與細(xì)菌類似，菌落表面光滑、大而突起、濕潤、稍透明。菌體比細(xì)菌大而且不運(yùn)動，是常見細(xì)菌的幾倍到幾十倍，在高倍鏡下可以清楚看到。酵母菌的繁殖方式分為無性繁殖和有性繁殖兩種，以無性繁殖為主。芽殖是酵母菌普遍的無性繁殖方式，少數(shù)為裂殖；有性繁殖是產(chǎn)生子囊和子囊孢子。由于細(xì)胞個體大，采取涂片的方法制片有可能損傷細(xì)胞，一般通過美藍(lán)染液水浸片或水一碘液水浸片法來觀察酵母的形態(tài)和芽殖方式。同時，采用美藍(lán)染液水浸片法還可以對酵母的死、活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。美藍(lán)是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。用美藍(lán)對酵母活細(xì)胞染色時，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，而對代謝作用微弱或死的細(xì)胞，無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。因此，本實(shí)驗通過美藍(lán)染液水浸片法觀察酵母細(xì)胞形態(tài)和出芽生殖方式以及鑒別酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞。（細(xì)胞之間單個分散或假絲狀；球狀、卵圓狀或假絲狀）2.霉菌霉菌可產(chǎn)生復(fù)合分枝的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多，常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。可以采用直接制片和透明膠帶法觀察，也可以采取載玻片培養(yǎng)觀察法，通過無菌操作將薄層培養(yǎng)基瓊脂置于載玻片上，接種后蓋上蓋玻片培養(yǎng)，使菌絲體在載玻片和蓋玻片之間的培養(yǎng)基中生長，將培養(yǎng)物直接置于顯微鏡下可觀察到霉菌自然生長狀態(tài)并可連續(xù)觀察不同發(fā)育期的菌體結(jié)構(gòu)特征變化。對霉菌可利用乳酸石炭酸棉藍(lán)染液進(jìn)行染色，蓋上蓋玻片后制成霉菌制片鏡檢。石炭酸可以殺死菌體及孢子并可以防腐，乳酸可以保持菌體不變形，棉藍(lán)使菌體著色。同時，這種霉菌制片方法不易干燥，能防止孢子飛散，用樹膠封固后可制成永久標(biāo)本長期保存。（菌落干燥、大而疏松或大而致密、不透明、顏色多樣；細(xì)胞之間絲狀交織）

三、試劑與器材

1.材料酵母菌、霉菌；

2.試劑呂氏堿性美藍(lán)染色液，乳酸石炭酸棉藍(lán)染液；

3.器材顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、灑精燈等。

四、實(shí)驗內(nèi)容

1.酵母菌---美藍(lán)染液水浸片法=1\*GB3①制片：載玻片中央滴加一滴0.1%美藍(lán)染液，無菌操作下用接種環(huán)挑取少許酵母菌置于染液中，混合均勻；②染色：用鑷子取一塊蓋玻片，將蓋玻片一邊與菌液接觸，緩慢將蓋玻片傾斜并覆蓋在菌液上，染色3min；③鏡檢：用低倍鏡和高倍鏡觀察酵母菌形態(tài)和出芽情況，并根據(jù)顏色區(qū)分死活細(xì)胞；④30分鐘后再鏡檢觀察，注意死活細(xì)胞數(shù)量是否發(fā)生變化。

2.霉菌---乳酸石炭酸棉藍(lán)直接壓片法觀察①用牙簽從霉菌瓊脂平板培養(yǎng)物取下一塊薄薄的瓊脂塊（要薄些），②50%酒精溶液中洗去脫落孢子③使用牙簽將霉菌培養(yǎng)基放于載玻片上，加蓋玻片④手指用力均勻按壓2-3次，使霉菌平鋪載玻片上，取下蓋玻片，將培養(yǎng)基碎塊挑出⑤滴加一滴棉藍(lán)染液，加蓋玻片吸水紙吸取多余染液⑥鏡檢：用低倍鏡和高倍鏡觀察霉菌的形態(tài)

五、關(guān)鍵步驟及注意事項

①染液不宜過多或過少，否則，在蓋上蓋玻片時，菌液溢出或出現(xiàn)大量氣泡。

②用鑷子取一塊蓋玻片，先將一側(cè)與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下，使其蓋在菌液上，蓋玻片不宜平著放下，避免氣泡產(chǎn)生。③用接種環(huán)將菌體與染料混合時不要劇烈涂抹，以免破壞細(xì)胞。④在直接制片觀察過程中，用鑷子和用解剖針取菌時要細(xì)心，盡量減少菌絲斷裂及形態(tài)破壞，蓋蓋玻片時避免氣泡產(chǎn)生。六、思考題1.繪制高倍鏡下酵母菌和霉菌的形態(tài)特征圖；2.30分鐘后，酵母菌死活細(xì)胞的變化并分析原因。出芽繁殖：是酵母菌的主要無性繁殖方式；出芽繁殖的過程是在成熟的酵母菌細(xì)胞表面，向外突出形成芽體，然后部分核物質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入芽體內(nèi)。當(dāng)芽體長到一定程度時，兩細(xì)胞之間形成橫壁，隨后脫離母細(xì)胞，成為獨(dú)立的新個體（子細(xì)胞）?！倬z：未脫落沒細(xì)胞的芽細(xì)胞上又長出新芽。分裂繁殖：如易變裂殖酵母，當(dāng)細(xì)胞長到一定大小時，核先分裂為二，接著形成隔膜將細(xì)胞分開，成為兩個子細(xì)胞。（裂殖與細(xì)菌類似）將出芽繁殖用圖畫出，使學(xué)生可以形象的理解，并有目的的進(jìn)行觀察染液：染液適量，不宜過多或者過少，否則用蓋玻片覆蓋時，染液過多則會溢出，過少則會產(chǎn)生大量氣泡混合：由于細(xì)胞較大，用接種環(huán)將菌體與染料混合時不要劇烈涂抹，