第一章 基因工程緒論

基因工程第一章緒論一、為什么學習基因工程？（人類面臨的問題）二、基因工程的四大里程碑三、基因工程的三大技術發(fā)明四、基因工程的研究內容《荷塘月色》基因工程技術版紫外光如流水一般，靜靜地瀉在這一塊瓊脂糖凝膠和PE手套上，細細的亮亮的PCR產(chǎn)物條帶呈現(xiàn)在眼前，仿佛在Running緩沖液中洗過一樣。雖然是白天，但是因為有一只暗箱，所以沒有朗照，紫外光是隔著石英玻璃照過來的，除了引物DNA在溴酚藍前有微弱的亮帶外，紅紅PCR產(chǎn)物如少女亭亭玉立般等著你的賞析、拍照。

基因之《大話西游版》曾經(jīng)有一段真誠的目的基因放在我質粒的面前，我沒有珍惜,等到失去的時候才追悔莫及?；蚬こ讨凶钔纯嗟氖虑槟^于此。如果實驗員能夠給我一個重新來過的機會，我會對那段基因說三個字，克隆吧。如果非要給這份技術加上一個方法，我希望是，PCR?；蚬こ膛c夢想西方傳說中的美人魚人類對新生物的構想意大利人的頭發(fā)埃及人的眼睛希臘人的鼻子美國人的牙齒泰國人的脖子澳洲人的胸部瑞士人的手斯堪的納維亞人的腿中國人的腳奧地利人的聲音日本人的笑容英國人的皮膚法國人的曲線西班牙人的步態(tài)克莉絲汀-戴維斯夢想中完美女性一、為什么學習基因工程？（人類面臨的問題）人口問題人類面臨重大問題與我們息息相關人口問題人口問題糧食問題人類面臨重大問題與我們息息相關為什么要學習生命科學？人口問題糧食問題健康問題人類面臨重大問題與我們息息相關為什么要學習生命科學？健康問題《2019國民健康洞察報告》《報告》從國民的健康現(xiàn)狀、健康素養(yǎng)、健康生活訴求、醫(yī)療服務訴求、健康消費訴求五個角度分析。人口問題糧食問題健康問題為什么要學習生命科學？環(huán)境問題人類面臨重大問題與我們息息相關解決之道？基因工程技術人口糧食環(huán)境醫(yī)療資源…二、基因工程的四大里程碑四大里程碑遺傳物質的明確——DNADNA雙螺旋結構理論（半保留復制及其中心法則）基因遺傳密碼子的破譯基因轉移載體的發(fā)現(xiàn)里程碑之一

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遺傳物質的發(fā)現(xiàn)基因的化學本質經(jīng)典試驗---肺炎鏈球菌的轉化試驗（1928年）（I）FrederickGriffith(1879–1941)肺炎鏈球菌是一類能夠引起肺炎等疾病的革蘭氏陽性菌。它存在兩種類型：R型：rough，菌體無莢膜，菌落粗糙，無致病性，不致死。S型：smooth，菌體具有莢膜，菌落光滑，致病性強，致死?；虻幕瘜W本質經(jīng)典試驗---肺炎鏈球菌的轉化試驗（1928年）（I）FrederickGriffith(1879–1941)實驗證明，在S型中有一種“轉化因子”(transformingprinciple)促成了R型的轉化。R型S型？1944年，Avery精確重復轉化實驗，確定了轉化因子。經(jīng)典試驗---肺炎鏈球菌的轉化試驗（II）OswaldAvery（1877-1955）RockefellerInstituteforMedicalResearch（I）加S型菌的DNA長出S型菌1944年，Avery精確重復轉化實驗，確定了轉化因子。經(jīng)典試驗---肺炎鏈球菌的轉化試驗（II）（1）從活的S型菌中抽提各種細胞成分（DNA，RNA，蛋白質，莢膜多糖等）（2）對各種生化組分進行轉化試驗活R型菌（II）加S型菌的DNA和DNA酶以外的酶（III）加S型菌的DNA和DNA酶只長R型菌（IV）加S型菌的RNA（V）加S型菌的蛋白質（VI）加S型菌的莢膜多糖實驗證明，S型菌轉移給R型菌的轉化因子是DNA。噬菌體的遺傳物質是DNA的實驗里程碑之二---DNA雙螺旋結構理論里程碑之二---DNA雙螺旋結構理論40年代末，英國科學家莫里斯·威爾金斯等用X射線衍射技術對DNA結構潛心研究了3年，意識到DNA是一種螺旋結構。1951年底，女物理學家羅莎琳德·富蘭克林拍到了一張十分清晰的DNA的X射線衍射照片。照片51號里程碑之二---DNA雙螺旋結構理論威爾金斯出示了富蘭克林在一年前拍下的DNAX射線衍射照片，沃森看出了DNA的內部是一種螺旋形的結構，他立即產(chǎn)生了一種新概念：DNA不是三鏈結構而應該是雙鏈結構。照片51號1953年，J.Watson和F.Crike創(chuàng)立DNA雙螺旋模型，證實基因是具有一定遺傳效應的DNA片段。里程碑之二---DNA雙螺旋結構理論1958年，富蘭克林因支氣管肺炎及卵巢癌逝世于英國倫敦。1963年，沃森、克里克和威爾金斯榮獲諾貝爾生物學或醫(yī)學獎。被遺忘的英格蘭玫瑰：羅莎琳德·富蘭克林（RosalindFranklin）（1920年7月25日-1958年4月16日）DNA二級結構的多態(tài)性A型，右手螺旋，外形粗短，常見的是dsRNA，A-DNA，DNA-RNA；B型，典型的

Watson-Crick雙螺旋DNA，是生理條件下有機序列，DNA分子中最穩(wěn)定的結構，也是研究的參照標準點；Z型，左手螺旋，外形細長，可以與B型DNA之間互相轉換。里程碑之三---遺傳密碼的發(fā)現(xiàn)遺傳密碼是通用的，將DNA或RNA序列以三個核苷酸為一組的密碼子轉譯為蛋白質的氨基酸序列，以用于蛋白質合成，在所有生物中都是相同的。里程碑之三---遺傳密碼的發(fā)現(xiàn)遺傳密碼是通用的，將DNA或RNA序列以三個核苷酸為一組的密碼子轉譯為蛋白質的氨基酸序列，以用于蛋白質合成，在所有生物中都是相同的。

1961年，美國國家衛(wèi)生院的海因里?！ゑR太與馬歇爾·沃倫·尼倫伯格在無細胞系統(tǒng)環(huán)境下，把一條只由尿嘧啶（U)組成的RNA翻譯成一條只有苯丙氨酸（Phe）的多肽，由此破解了首個密碼子（UUU->Phe）。里程碑之三---遺傳密碼的發(fā)現(xiàn)遺傳密碼是通用的，將DNA或RNA序列以三個核苷酸為一組的密碼子轉譯為蛋白質的氨基酸序列，以用于蛋白質合成，在所有生物中都是相同的。

1961年，美國國家衛(wèi)生院的海因里?！ゑR太與馬歇爾·沃倫·尼倫伯格在無細胞系統(tǒng)環(huán)境下，把一條只由尿嘧啶（U)組成的RNA轉釋成一條只有苯丙氨酸（Phe）的多肽，由此破解了首個密碼子（UUU->Phe）。隨后科拉納（HarGobindKhorana）破解了其它密碼子，接著霍利（RobettW.Holley）發(fā)現(xiàn)了負責轉錄過程的tRNA。里程碑之三---遺傳密碼的發(fā)現(xiàn)1968年，科拉納、霍利和尼倫伯格分享了諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。里程碑之三---遺傳密碼的發(fā)現(xiàn)霍利（1922-1993），科拉納（1922-2011），尼倫伯格（1927-2010）里程碑之四---基因轉運載體的發(fā)現(xiàn)Fig.4.-ElectronmicrographstakenofColE1DNApurifiedbyMAKcolumnchromatography.(a)OpenandsupercoiledcircularDNAofthe2.3-jclass.X49,000.(b)Anopen2.3-ucircularmoleculejuxtaposedtoitssupercoiledallomorph.X56,000.(c)Supercoiledforms(2.3uand4.7u).X56,000.(d)Opencircularforms(2.3pand4.7IA).X56,000'(e)SupercoiledcircularformofColElDNA,4.7-tt,extractedbytheMarmurproceduresSuper-coiledformsthusextractedappearedmoretightlytwisted.X56,000.1967年，羅思和海林斯基發(fā)現(xiàn)細菌染色體DNA之外的質粒有自我復制的能力，并可以在細菌細胞間轉移，這一發(fā)現(xiàn)為基因轉移找到一種運載工具。Roth

TF,

Helinski

DR.PNAS.

1967;58(2):650–657里程碑之四---基因轉運載體的發(fā)現(xiàn)（1）FIG.1.GeneralprotocolforproducingcovalentlyclosedSV40dimercirclesfromSV40(I)DNA.1972年斯坦福大學的PaulBerg小組完成了首次體外重組實驗：將SV40的DNA片斷與大腸桿菌的DNA片斷連接起來。標志著基因工程技術的誕生Jackson,D.A.,Symons,R.H.andBerg,P.PNAS。1972。69:2904-2909里程碑之四---基因轉運載體的發(fā)現(xiàn)（2）1980NobelPrizeinChemistryBoyer-Cohen實驗1973年斯坦福大學的S.

Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌pSC101質粒與含有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質粒pSC102連接成重組質粒，具有雙重抗藥性。StanleyN.Cohen,AnnieC.Y.Chang,HerbertW.Boyer,andRobertB.Helling.PNAS。197370(11)3240-3244里程碑之四---基因轉運載體的發(fā)現(xiàn)（3）KanamycinandTetracyclinresistantE.coliTetracyclinresistantgeneKanamycinresistantgeneEcoRIEcoRI三、基因工程的三大技術發(fā)明三大技術發(fā)明工具酶的發(fā)明：內切酶、合成酶、連接酶PCR技術（PCR擴增儀）基因合成和測序（合成儀、測序儀）技術發(fā)現(xiàn)之一---工具酶技術發(fā)現(xiàn)之一---工具酶（1）人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙，即所謂寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象的簡稱（Restriction/Modification,R/M體系）。細菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。大多數(shù)限制性內切酶常常伴隨有1~2種修飾酶（DNA甲基化酶），后者能保護細胞自身的DNA不被限制性內切酶破壞。技術發(fā)現(xiàn)之一---工具酶（2）1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coli

B和E.coli

K中分離出的核酸內切酶EcoB和EcoK，是I型的，沒有實用價值。技術發(fā)現(xiàn)之一---工具酶（3）1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分離出的限制酶HindII，是特異性切割的II型。工具酶種類核糖核酸酶（Rnase）

脫氧核糖核酸酶（Dnase）DNA連接酶、RNA連接酶(ligase)

DNA聚合酶（DNApolymerase）

RNA聚合酶（RNApolymerase）

反轉錄酶（reversetranscriptase）

限制性核酸內切酶（restrictionendonucease）技術發(fā)現(xiàn)之二---PCR技術

（PCR擴增儀）在1983年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的科學家K.B.Mullis發(fā)明的PCR技術。PCR是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，有稱之為體外擴增法。技術發(fā)現(xiàn)之二---PCR技術（PCR擴增儀）技術發(fā)現(xiàn)之二---PCR技術（PCR擴增儀）技術發(fā)現(xiàn)之二---PCR技術（PCR擴增儀）技術發(fā)現(xiàn)之二---PCR技術（PCR擴增儀）技術發(fā)現(xiàn)之二---PCR技術（DNA聚合酶）技術發(fā)現(xiàn)之三---基因合成儀和測序儀DNA測序技術（1）第一代測序，Sanger法（鏈終止法）、化學降解法，凝膠電泳；技術發(fā)現(xiàn)之三---基因合成儀和測序儀（1）DNA測序技術（1）第一代測序，Sanger法（鏈終止法）、化學降解法，凝膠電泳；（2）第二代測序，Roche公司的454技術（焦磷酸測序）、ABI公司的SOLiD技術和Illumina公司的Solexa技術，高通量測序技術；技術發(fā)現(xiàn)之三---基因合成儀和測序儀（1）DNA測序技術（1）第一代測序，Sanger法（鏈終止法）、化學降解法，凝膠電泳；（2）第二代測序，Roche公司的454技術（焦磷酸測序）、ABI公司的SOLiD技術和Illumina公司的Solexa技術，高通量測序技術；（3）第三代測序，PacBio的SMRT技術和OxfordNanoporeTechnologies公司的納米孔單分子技術，單分子測序。技術發(fā)現(xiàn)之三---基因合成儀和測序儀（1）PacBio的SMRT技術DNA測序技術（1）第一代測序，Sanger法（鏈終止法）、化學降解法，凝膠電泳；（2）第二代測序，Roche公司的454技術（焦磷酸測序）、ABI公司的SOLiD技術和Illumina公司的Solexa技術，高通量測序技術；（3）第三代測序，PacBio的SMRT技術和OxfordNanoporeTechnologies公司的納米孔單分子技術，單分子測序。技術發(fā)現(xiàn)之三---基因合成儀和測序儀（1）DNA合成技術，按照預定核苷酸的順序，將脫氧核苷酸逐個進行人工連接合成DNA鏈的方法。目前多是采用固相合成法，即是在多聚體支持物上從3′端延伸核苷酸，可自動化操作。技術發(fā)現(xiàn)之三---基因合成儀和測序儀（2）以上研究成果綜合，催生了基因工程

自基因工程問世以的三十幾年，是基因工程迅速發(fā)展的階段。如果說20世紀八九十年代是基因工程基礎研究趨向成熟，那么二十一世紀初將是基因工程應用研究的鼎盛時期?；蚬こ痰难杆侔l(fā)展階段二、基因克隆的概念與基本步驟1．基因克隆的概念1972年，以P.Berg等人為代表的一批科學家發(fā)展了有關重組DNA的技術；1973年，H.Boyer和Cohen完成了第一個基因的克隆，由此宣告了基因克隆技術的誕生?！翱寺　保╟lone）一詞作名詞使用時是指從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細胞或個體所組成的特殊的群體；作動詞使用時，是指產(chǎn)生這一群體的過程?；蚩寺∈侵冈隗w外，借助于能自我復制的載體分子，將目的基因引入到宿主細胞中進行增殖，以獲得大量純一的特定DNA片段的過程。同義詞包括：重組DNA，分子克隆，遺傳工程,基因工程等A重組DNA技術的基本定義

重組DNA技術是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。B基因工程的基本定義

基因工程是指重組DNA技術的產(chǎn)業(yè)化設計與應用，包括上游技術和下游技術兩大組成部分。上游技術指的是基因重組、克隆和表達的設計與構建（即重組DNA技術）；下游技術則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。C重組DNA技術與基因工程的基本用途

分離、擴增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質設計、構建生物的新性狀甚至新物種大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質工程細胞基因工程蛋白質工程途徑工程發(fā)酵工程細胞工程分離工程酶酶工程分離工程天然細胞天然細胞生物活性物質生物活性物質D基因工程的基本形式第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表達經(jīng)典基因工程第二代基因工程蛋白編碼基因的定向誘變蛋白質工程第三代基因工程代謝信息途徑的修飾重構途徑工程第四代基因工程基因組或染色體的轉移基因組工程第五代基因工程基因編輯基因組工程四、基因工程的研究內容（1）基因工程載體的研究

原核載體和真核載體；克隆載體和表達載體；質粒載體、噬菌體載體、病毒載體及其他載體等?；蚬こ梯d體的研究是基因工程研究的重要內容之一。1．基因克隆工具的研究（2）工具酶的研究主要包括：限制性核酸內切酶DNA連接酶DNA聚合酶各種修飾酶

1．基因克隆工具的研究（3）基因工程受體系統(tǒng)的研究受體是載體的宿主，是外源基因表達的場所。受體可以是單個細胞，也可以是組織、器官、甚至是個體。目前最常用的受體系統(tǒng)是大腸桿菌受體系統(tǒng)和酵母受體系統(tǒng)。其他受體系統(tǒng)：鏈霉菌、芽孢桿菌、絲狀真菌及動物細胞。利用動物的組織（如：乳腺組織、胚胎組織等）作為受體進行基因表達的研究等1．基因克隆工具的研究以PCR為基礎的差異篩選技術長片段的DNA序列測定技術高通量的基因芯片技術高通量測序技術借助計算機和互聯(lián)網(wǎng)的生物信息技術，等等……2．基因克隆技術的研究基因是一種有限的重要戰(zhàn)略性資源人類基因組計劃中科學家們的最新研究結果，人類基因總數(shù)比預期的低得多，初步定位在3.0萬個左右，如此少的基因自然成為激烈競爭的對象。3．克隆對象——目的基因的研究我國科學家完成的水稻基因組測序研究成果發(fā)表在國際權威的SCIENCE雜志2014年全球轉基因作物在各國的種植面積（百萬公頃）

基因工程藥物——高新技術產(chǎn)業(yè)——新的藥業(yè)革命1982年美國Lily公司首先將重組胰島素投