多肽類仿制藥研發(fā)和一致性評價的考慮

隨著多肽合成工藝的成熟和藥物制劑技術(shù)的提高，多肽類藥物已成為國內(nèi)外藥物研發(fā)公司關(guān)注的重點(diǎn)。在2017年度FDA批準(zhǔn)的46個新藥中，有6個為多肽類藥物［1］，為多肽類藥物年批準(zhǔn)數(shù)量的歷史新高，證明多肽類藥物開發(fā)已進(jìn)入“快車道”。我國多肽類藥物開發(fā)起步較晚，原料藥的可及性、高端制劑的技術(shù)瓶頸等都制約了多肽類藥物的發(fā)展。隨著重大新藥創(chuàng)制專項和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)“十二五”規(guī)劃的重點(diǎn)扶持，近幾年多肽類藥物技術(shù)難點(diǎn)有了重大突破，國內(nèi)多肽類藥物申報數(shù)量逐漸提高。但由于技術(shù)實(shí)力差異和多肽類藥物開發(fā)指導(dǎo)性文件的不完善，申請人遞交的申報資料質(zhì)量參差不齊，部分遞交資料存在嚴(yán)重缺陷，影響了此類產(chǎn)品的研制和注冊申報。針對上述情況，本作者曾發(fā)表2篇文獻(xiàn)［2－3］，結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)性文件，對多肽類藥物原料藥的合成工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、雜質(zhì)研究等方面進(jìn)行了探討。本文結(jié)合國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《關(guān)于藥品注冊審評審批若干政策的公告》(2015年第230號)、《關(guān)于仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價工作有關(guān)事項的公告》(2017年第100號)、《化學(xué)藥品注射劑仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價技術(shù)要求(征求意見稿)》等相關(guān)政策文件的要求，對已上市多肽類藥物存在的問題進(jìn)行了回顧，并對該類藥物在一致性評價、仿制藥申請中應(yīng)關(guān)注的問題進(jìn)行探討。Part1、我國多肽類藥物現(xiàn)狀

多肽類藥物在我國近幾年的銷售額均保持比較快速的增長態(tài)勢，其中奧曲肽、生長抑素、曲普瑞林、亮丙瑞林等品種銷售額均過億元。但我國可自主生產(chǎn)的多肽類藥物產(chǎn)品初級、附加值低。目前，多數(shù)市場前景廣闊的藥物仍主要依靠進(jìn)口，如胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物等可能存在多種原因:①

原料藥的可及性。目前，國內(nèi)具備商業(yè)化生產(chǎn)高質(zhì)量多肽原料藥能力的企業(yè)較少，且具有原料藥生產(chǎn)能力企業(yè)所生產(chǎn)的原料藥多數(shù)僅供本公司制劑使用，市場上能購買到藥用級別高質(zhì)量的原料藥較少，在源頭上限制了多肽類藥物的發(fā)展。②

關(guān)鍵制劑技術(shù)尚需突破。部分特殊多肽制劑，如緩釋微球、脂質(zhì)體、吸入制劑等劑型，現(xiàn)國內(nèi)掌握上述制劑核心技術(shù)的企業(yè)較少，從另一方面制約了該類多肽藥物的上市。③

研發(fā)企業(yè)的關(guān)注度。由于多肽類藥物是介于大分子蛋白藥物和小分子化學(xué)藥物之間的一類特殊藥物，其研發(fā)、生產(chǎn)均具有一定的特殊難度。國內(nèi)大多數(shù)制藥企業(yè)未涉獵過此類藥物，對該類藥物的關(guān)注度較低，因此導(dǎo)致仿制數(shù)量比小分子化學(xué)藥物低很多。如化學(xué)小分子藥物帕瑞西布鈉，專利過期后，即有數(shù)十個企業(yè)申報生產(chǎn)，而多肽類藥物特利加壓素專利早已過期，目前國內(nèi)僅有個別仿制藥企業(yè)獲準(zhǔn)生產(chǎn)。國內(nèi)部分已上市的多肽類藥物上市時間較早，近年我國成為ICH成員國，藥品的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)與國際接軌，隨著我國藥品一致性評價工作全面展開，早期上市的多肽類藥物可能無法滿足一致性評價技術(shù)要求，已有生產(chǎn)批準(zhǔn)文號的多肽生產(chǎn)企業(yè)將面臨巨大的挑戰(zhàn)。Part2、參比制劑的確定

按照我國藥監(jiān)機(jī)構(gòu)發(fā)布的法規(guī)文件，仿制藥品應(yīng)與參比制劑保持質(zhì)量和療效一致。中共中央辦公廳、國務(wù)院辦公廳于2017年發(fā)布《關(guān)于深化審評審批制度改革鼓勵藥品醫(yī)療器械創(chuàng)新的意見》，明確要求我國應(yīng)逐步建立橙皮書制度，明確各藥品的參比制劑。由于仿制藥橋接了參比制劑質(zhì)量控制、安全性有效性信息，申請人在開發(fā)多肽仿制藥時，應(yīng)高度重視參比制劑的選擇。除了參考《關(guān)于發(fā)布化學(xué)仿制藥參比制劑遴選與確定程序的公告》(2019年第25號)以外，還應(yīng)該對產(chǎn)品在國外上市時制劑處方合理性、臨床試驗(yàn)規(guī)范性科學(xué)性、說明書的權(quán)威性等進(jìn)行全面考察。以注射用縮宮素為例，分享參比制劑選擇時在藥學(xué)方面的一些考慮。在美國、歐洲和日本上市的縮宮素注射液，均有獲得國內(nèi)參比制劑資格的可能性，如美國AppPharmaceuticals，LLC、歐洲MylanProductsLtd、日本武田薬品工業(yè)株式會社等公司產(chǎn)品。對于仿制注射劑，原則上Q1，Q2與參比制劑一致，即處方中輔料種類和用量一致;其次《化學(xué)藥品注射劑基本考慮(試行)》要求，在滿足需要的前提下，注射劑所用輔料的種類及用量應(yīng)盡可能減少。處方中是否含有乙醇是歐洲、美國、日本上市產(chǎn)品處方組成的主要差別。日本、美國上市產(chǎn)品中不含乙醇，歐洲上市產(chǎn)品中含有乙醇，同時檢索發(fā)現(xiàn)歐洲近期批準(zhǔn)產(chǎn)品中也不含乙醇，因此需對處方中乙醇的作用以及存在必要性進(jìn)行詳細(xì)分析，并結(jié)合產(chǎn)品上市前臨床研究和說明書等信息明確參比制劑。Part3、多肽原料藥質(zhì)量

多肽原料藥質(zhì)量控制相對復(fù)雜，在《制備工藝和過程控制對合成多肽藥物有關(guān)物質(zhì)的影響》和《合成多肽藥物質(zhì)控及雜質(zhì)譜研究》中闡述了如何結(jié)合保護(hù)氨基酸質(zhì)量控制、縮合過程控制、純化控制、中間體控制等綜合實(shí)現(xiàn)多肽類藥物的質(zhì)量控制［2－3］。在此需要明確合成多肽藥物的過程控制更為重要，是多肽類仿制藥申請和一致性評價申請?zhí)嵘|(zhì)量的重點(diǎn)。在全面研究的基礎(chǔ)上，才可能實(shí)現(xiàn)對多肽類藥物的充分質(zhì)控，僅靠檢測手段可能無法有效評估產(chǎn)品質(zhì)量，以下分享2個可能引起多肽類藥物質(zhì)量風(fēng)險的實(shí)例。對于小分子化學(xué)藥，合成路線不同造成雜質(zhì)譜的差異有限，經(jīng)過相應(yīng)的分析及研究基本可全面覆蓋潛在雜質(zhì)譜的差異。多肽類藥物不同于小分子化學(xué)藥，其合成路線較多，同一條肽鏈可以利用固相合成、液相合成、固相液相結(jié)合的片段合成等手段制備，即合成路線選擇較多，造成工藝雜質(zhì)與參比制劑存在較大差異。從目前申報資料上看，國內(nèi)基本采用從C端到N端逐步偶聯(lián)的手段制備，而多數(shù)國外原研企業(yè)采用固相合成制備多肽片段，再偶聯(lián)成整條肽鏈。暫且不分析合成路線合理性問題，但不同合成路線可能導(dǎo)致雜質(zhì)譜存在較大差別。以美國藥典收載的艾塞那肽為例，盡管藥典收載的有關(guān)物質(zhì)分析方法多達(dá)3種，但有部分申請人開發(fā)之后仍發(fā)現(xiàn)藥典收載方法存在不可檢出的工藝雜質(zhì)。藥典收載的方法可能主要源于原研品方法，由于仿制企業(yè)采用的合成路線不同，所產(chǎn)生的雜質(zhì)譜不一致。僅采用藥典或原研進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)物質(zhì)分析方法可能無法全面揭示仿制藥雜質(zhì)水平，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量存在風(fēng)險。因此，對于多肽類藥物需進(jìn)行詳細(xì)的雜質(zhì)譜分析并采用相應(yīng)的雜質(zhì)對照品對分析方法的檢出能力進(jìn)行全面驗(yàn)證，僅采用已有的分析方法進(jìn)行考察，很可能造成雜質(zhì)漏檢等質(zhì)控缺陷。對于雜質(zhì)含量方面，需要注意某些雜質(zhì)即便滿足安全水平范圍，但也可能對多肽藥物的穩(wěn)定性存在較大影響。比如，某多肽類藥物收載于《中華人民共和國藥典》，藥典對有關(guān)物質(zhì)的要求為最大未知單雜不得過2．0%。在審評過程中發(fā)現(xiàn)按藥典收載方法檢測，參比制劑主峰后為單一雜質(zhì)峰，多數(shù)國產(chǎn)制劑主峰后存在2個雜質(zhì)峰，其中1個雜質(zhì)峰與參比制劑雜質(zhì)峰相對保留時間相同，應(yīng)該為同一雜質(zhì)，多出的雜質(zhì)峰為新增未知雜質(zhì)。雜質(zhì)含量未超過最大未知單雜的控制限度要求。盡管初始雜質(zhì)水平較低且符合藥典要求，但在穩(wěn)定性考察過程中，新增的未知雜質(zhì)增長較快，12個月后已接近控制限度要求，而參比制劑主峰后仍基本維持一個雜質(zhì)峰。分析該雜質(zhì)可能是酰胺類水解雜質(zhì)，在體系內(nèi)殘留的少量雜質(zhì)可能發(fā)生類似“鏈引發(fā)”反應(yīng)，造成仿制產(chǎn)品的雜質(zhì)增長水平遠(yuǎn)高于參比制劑。Part4、多肽類藥物的結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu)是基礎(chǔ)，如果結(jié)構(gòu)上存在差異，仿制產(chǎn)品的活性可能弱于參比制劑，甚至沒有活性。多肽類藥物結(jié)構(gòu)確證與小分子藥物存在較大差別，可能具有高級結(jié)構(gòu)，常用可以反映多肽藥物結(jié)構(gòu)的方法如下。一級結(jié)構(gòu)確證方法:

可以采用質(zhì)譜測定其分子量，用質(zhì)譜結(jié)合酶切進(jìn)行肽序的鑒定，或者采用Edman降解進(jìn)行肽序的鑒定。二級結(jié)構(gòu)確證方法:

多肽二級結(jié)構(gòu)實(shí)際上是肽鏈因氫鍵而形成的局部結(jié)構(gòu)，研究手段有X-射線單晶衍射、二維NMR、FT-IR及遠(yuǎn)紫外CD等方法。其中X-射線單晶衍射及二維NMR測的最為準(zhǔn)確，但多肽的單晶不易培養(yǎng)，而且不代表溶液中的真實(shí)情況，而二維NMR耗時長、解析困難，并且分析通量低，所以這2種方法一般用得較少;目前采用最多的是FT-IR與遠(yuǎn)紫外CD法。三級結(jié)構(gòu)確證方法：對于復(fù)雜多肽可能有三級結(jié)構(gòu)存在，三級結(jié)構(gòu)研究常用的方法有熒光光譜及近紫外CD等，其原理是利用芳香氨基酸側(cè)鏈的微環(huán)境變化帶來熒光發(fā)射光譜和近紫外CD譜的差異。但該方法目前只能進(jìn)行定性對比研究，無法進(jìn)行明確的結(jié)構(gòu)確證，只能作為三級結(jié)構(gòu)研究的參考。四級結(jié)構(gòu)確證方法:

多肽及蛋白功能性聚集是高級結(jié)構(gòu)的一種反映，它包含兩方面信息:聚集單體的數(shù)量和聚集后的空間構(gòu)象。常用的分析方法包括場流分離、超速離心。生物活性研究方法:

由于高級結(jié)構(gòu)確證可能存在一定的不確定性，可通過測試生物活性間接證明多肽類藥物高級結(jié)構(gòu)的正確性。如表2所統(tǒng)計已收入美國藥典的11個多肽類藥物有4個制劑和1個原料藥需要測定生物活性，越來越多的多肽類藥物需要增加生物活性的研究和檢測。目前，對于多肽及蛋白的活性研究有體外(invitro)及體內(nèi)(invivo)2種路徑。invitro評價方法包括但不限于酶動力學(xué)、結(jié)合力測定、生物活性測定;其中酶動力學(xué)測定采用酶促反應(yīng);結(jié)合力測定，如果是分子之間采用表面等離子共振技術(shù)(SPR)、生物膜層干涉技術(shù)(BLI)以及微量差示掃描量熱技術(shù)(NanoDSC)等技術(shù)完成，如果是和細(xì)胞表面的受體結(jié)合一般采用均相時間分辨熒光等技術(shù)完成;生物活性一般采用藥物刺激細(xì)胞，采用均相時間分辨熒光等技術(shù)檢測其產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)來完成［4］。invivo評價一般采用動物或動物器官，如機(jī)理明確則檢測具體某種化合物指標(biāo)，如不明確則觀察具體的治療效果。例如可采用小鼠的EAE模型來評價醋酸格拉替雷對多功能硬化癥的癥狀延遲及減輕效果［5］。對于多肽類藥物而言，結(jié)構(gòu)確證部分不同于小分子化學(xué)藥物。小分子化學(xué)藥物一般在原料藥部分明確結(jié)構(gòu)后，制劑開發(fā)中可不用進(jìn)一步研究。而多肽藥物由于高級結(jié)構(gòu)的不確定性，部分需要在制劑中與參比制劑進(jìn)行對比研究，以確定某一結(jié)構(gòu)含量與參比制劑的一致性。同時，由于多肽類藥物高級結(jié)構(gòu)與其所處環(huán)境有關(guān)，在結(jié)構(gòu)測試過程中可能脫離藥物實(shí)際使用環(huán)境，因此有必要采用多種相互補(bǔ)充的分析方法對比研究仿制品與參比制劑結(jié)構(gòu)的一致性。在此需要明確，并不是所有多肽類藥物都存在高級結(jié)構(gòu)，在合成中存在高級結(jié)構(gòu)的藥物僅占少數(shù)。在此建議產(chǎn)品開發(fā)者先通過參比制劑信息、文獻(xiàn)、專利等方面綜合檢索，明確是否存在高級結(jié)構(gòu)，再選擇適合的結(jié)構(gòu)確證手段進(jìn)行研究，避免過度開發(fā)。Part5、多肽制劑研究

多肽類藥物制劑絕大多數(shù)為注射劑，有少量口服制劑，如去氨加壓素、利那洛肽、索瑪魯肽等，有少量吸入制劑如去氨加壓素、鮭降鈣素等。本文主要結(jié)合《化學(xué)藥品注射劑仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價技術(shù)要求(征求意見稿)》對多肽類藥物注射劑與小分子化藥存在的潛在差異進(jìn)行重點(diǎn)討論。5.1處方工藝方面

輔料選擇問題:

盡管藥監(jiān)部門允許注射劑仿制藥在抑菌劑、緩沖劑、pH值調(diào)節(jié)劑、抗氧劑、金屬離子絡(luò)合劑等與參比制劑存在差異，但對于多肽制劑而言，所選擇輔料應(yīng)盡可能與參比制劑一致，主要原因有:肽鏈的穩(wěn)定性較差，酸、堿、金屬離子等可能引起肽鏈降解;肽類藥物結(jié)構(gòu)中存在多個裸露的氨基與羧基，可能會與輔料相互作用，形成相關(guān)的雜質(zhì);多肽類藥物可能存在高級結(jié)構(gòu)，細(xì)微的pH值、離子強(qiáng)度的差異可能引起結(jié)構(gòu)的變化。配液過程:

部分多肽類藥物對溶液pH值、氧含量、離子強(qiáng)度等敏感，在配制過程中，短時間脫離穩(wěn)定環(huán)境，會給多肽類藥物造成不良影響。對工藝細(xì)節(jié)的把握則更加關(guān)鍵，需對原輔料加入順序、攪拌時間、攪拌速度、是否需要避光除氧等進(jìn)行詳細(xì)的考察，確定是否對產(chǎn)品質(zhì)量造成影響。如某多肽制劑，前期工藝開發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)該藥物在相對較窄的pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定，擬定關(guān)鍵工藝參數(shù)pH值控制范圍也相對較窄。在首次工藝驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)，配液之后pH值在擬定控制范圍內(nèi)，但所制備部分終產(chǎn)品pH值已超出擬定控制范圍。主要原因是批量放大后，商業(yè)生產(chǎn)設(shè)備的攪拌性能低，多肽類藥物的溶解時間延長，藥物配置后pH值需在較長時間后達(dá)到穩(wěn)態(tài)。對攪拌速度、時間等工藝參數(shù)進(jìn)行詳細(xì)考察后，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)3批產(chǎn)品的穩(wěn)定生產(chǎn)。如某多肽制劑，3批工藝驗(yàn)證產(chǎn)品在12個月穩(wěn)定性留樣時，一批產(chǎn)品雜質(zhì)增加幅度明顯較另2批大，經(jīng)審查實(shí)際批生產(chǎn)記錄時發(fā)現(xiàn)，變化較大批次產(chǎn)品存在pH值回調(diào)問題。由于該產(chǎn)品工藝是將原料藥加入調(diào)好pH值的溶液中，回調(diào)之后體系離子強(qiáng)度增加，初步判斷是造成該降解現(xiàn)象的主要原因。申請人的補(bǔ)充研究顯示，如果體系中離子強(qiáng)度增加，加速試驗(yàn)可明顯發(fā)現(xiàn)藥物降解速度增加，因此在工藝規(guī)程中進(jìn)行了嚴(yán)格的限定，如pH值調(diào)節(jié)失敗，直接作為廢液處理，重新生產(chǎn)。凍干工藝問題:

多肽類藥物受穩(wěn)定性限制，采用注射給藥途徑時多選擇凍干注射劑。從申報資料來看，多數(shù)申請人僅以可凍干為目的開展研究，忽視凍干工藝對穩(wěn)定性的影響。由于藥物在凍干過程中可能存在緩沖劑結(jié)晶、pH值位移、穩(wěn)定劑形態(tài)改變、多肽空間構(gòu)象改變等諸多問題，進(jìn)而可直接影響多肽類藥物的穩(wěn)定性。如某進(jìn)口多肽制劑，擬定凍干工藝需40

℃保持較長時間，由于藥物擬定貯藏條件是2～8℃保存，因此在審評過程中對該過程提出疑問，要求申請人進(jìn)一步提供凍干工藝的合理性。申請人提供了不同凍干工藝條件下產(chǎn)品穩(wěn)定性的比較數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示二次升溫階段采用較高溫度時，產(chǎn)品長期放置過程中降解雜質(zhì)明顯少于全程均在低溫條件下凍干的產(chǎn)品。該過程可認(rèn)為是凍干工藝中的“退火”，可以起到釋放藥物能量、改善微觀結(jié)構(gòu)等作用，進(jìn)而達(dá)到進(jìn)一步穩(wěn)定多肽類藥物的目的。美國MichaelPikal教授在該方面進(jìn)行了深入研究［6］，可指導(dǎo)多肽類藥物凍干工藝的開發(fā)。特殊包裝形式問題:

部分降糖藥物采用卡式瓶預(yù)灌封技術(shù)，該類藥物由于制備工藝和使用方法的特殊性，需建立特別的研究手段。如卡式瓶在生產(chǎn)過程中一般需硅化處理，硅化步驟直接影響內(nèi)壁的光滑程度，進(jìn)而影響給藥劑量的準(zhǔn)確性。應(yīng)對硅油噴涂量、均勻性等進(jìn)行相應(yīng)的控制;由于給藥方式的特殊性，如制劑中含有氣泡，會導(dǎo)致對壓力反應(yīng)的不一致，直接引起給藥劑量不準(zhǔn)確，可在灌裝過程中采取多次注入的方式以減少氣體的引入;該類藥物涉及多次刺穿等問題，需對包材密封性進(jìn)行完整的考察。相容性問題:

部分多肽類藥物對生產(chǎn)設(shè)備可能引入的金屬雜質(zhì)較敏感，微量雜質(zhì)的引入可能引起肽鏈降解，導(dǎo)致仿制品的降解速度快于參比制劑。開展藥物與生產(chǎn)設(shè)備、濾器、藥物包材的相容性研究時，在小分子化藥關(guān)注研究內(nèi)容的基礎(chǔ)上，研究者應(yīng)提高對金屬離子等無機(jī)雜質(zhì)的關(guān)注度。另外，多肽類藥物給藥劑量通常較小，為了保證藥物劑量的準(zhǔn)確性，需要關(guān)注生產(chǎn)設(shè)備、濾器、包材對藥物的吸附，必要時可采用過量投料的方式予以解決，但應(yīng)提供充分依據(jù)。如某多肽制劑，申請人在前期開發(fā)中發(fā)現(xiàn)擬定生產(chǎn)設(shè)備可引入金屬離子，導(dǎo)致產(chǎn)品降解速率明顯加快。由于生產(chǎn)設(shè)備更換難度較大，申請人擬定配液工序使用一次性配液袋，避免了金屬離子的引入，進(jìn)而保證了產(chǎn)品質(zhì)量。專屬溶媒、注射器問題:

部分多肽參比制劑有專屬溶媒、專屬注射器具，仿制藥企業(yè)在開展研究時，需要關(guān)注藥物是否與臨床通用配伍溶媒、注射器存在相容性問題，應(yīng)充分評估專屬溶媒、注射器的必要性。如特利加壓素參比制劑，具有專屬溶劑氯化鈉水溶液，產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)附錄中對氯化鈉水溶液中氯化鈉濃度和pH值等做了較詳細(xì)的限定，目前臨床通用的配伍溶劑不滿足參比制劑擬定控制限度要求。國內(nèi)上市的注射用特利加壓素均未明確臨床配伍溶劑，因此在后續(xù)一致性評價等研究中需評估專屬溶劑的必要性及配伍使用過程中對產(chǎn)品質(zhì)量及患者耐受性等多方面的影響。5.2質(zhì)量研究方面

研究者應(yīng)結(jié)合多肽藥物的自身特點(diǎn)，在質(zhì)量研究中進(jìn)行針對性考察。對于穩(wěn)定性差的多肽類藥物，應(yīng)關(guān)注pH值、性狀、復(fù)溶時間、初始雜質(zhì)水平等是否與參比制劑一致?？赡軙嬖谫|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制限度較寬，仿制品可滿足擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，但與參比制劑相比仍存在一定差異的現(xiàn)象。上述差異可能說明多肽類藥物所處的微環(huán)境與參比制劑存在差異，在長期穩(wěn)定性考察中pH值、有關(guān)物質(zhì)、不溶性微粒等檢查項目有可能出現(xiàn)問題，研究者應(yīng)該重視上述差異，理解并查找原因，以免長期穩(wěn)定性考察中出現(xiàn)問