小鼠繁殖性能的觀察及研究報(bào)告

-.z.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)設(shè)計(jì)大綱實(shí)驗(yàn)名稱：C57BL／6小鼠繁殖性能的觀察與研究課題來(lái)源：自選設(shè)計(jì)班級(jí)：04級(jí)檢驗(yàn)本科設(shè)計(jì)人員：***設(shè)計(jì)日期：2007年5月26日指導(dǎo)教師：****醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)教研室2007年制一.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的意義,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的意義，國(guó)外研究現(xiàn)狀，存在的問(wèn)題，解決問(wèn)題的思路目的與意義:通過(guò)對(duì)C57BL／6小鼠的繁殖性能的研究從而提高其受孕率，到達(dá)最正確育種的目的。國(guó)外研究現(xiàn)狀：C57BL／6小鼠是little于1921年采用遺傳學(xué)原理，以毛色基因?yàn)闃?biāo)記育成的近交系小鼠。CBL／6純系小鼠性成熟早，36日齡雄性附睪精液中有運(yùn)動(dòng)的精子，雌鼠在37日齡即可動(dòng)情排卵、受孕。雌鼠在正常情況下，每隔4～5d為一個(gè)性周期，發(fā)情后2～3h即可排卵。妊娠期為19～21d，哺育期為20～22d。雌鼠產(chǎn)后還可出現(xiàn)一次動(dòng)情期，即分娩后24h排卵，此時(shí)交配可受孕，俗稱“血配〞，出現(xiàn)邊哺育邊妊娠的現(xiàn)象?，F(xiàn)有研究說(shuō)明交配季節(jié)在各種有關(guān)生殖的實(shí)驗(yàn)非常重要,一般應(yīng)在春秋二季節(jié)進(jìn)展。因小鼠怕熱畏寒，而這季節(jié)溫度比擬適宜，動(dòng)物的受孕率較高。假設(shè)在夏冬季實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物房室溫應(yīng)控制在(22±2)℃。研究說(shuō)明溫度、光照、噪音、濕度、營(yíng)養(yǎng)等因素對(duì)小鼠性周期影響很大。當(dāng)溫度低于10℃時(shí)，CBL／6純系小鼠受孕率極低，胚胎獲取常失敗。光照、溫度、噪音、濕度、營(yíng)養(yǎng)等因素對(duì)小鼠性周期影響很大。當(dāng)噪音高于80分貝時(shí)，小鼠煩躁不安，打架撕咬，幾乎沒(méi)有交配現(xiàn)象；當(dāng)空氣相對(duì)濕度低于30％時(shí)，小鼠脫毛現(xiàn)象嚴(yán)重，同時(shí)可使雌鼠受孕率降低，產(chǎn)仔數(shù)下降,為提高其產(chǎn)仔成活率現(xiàn)目前主要有兩種方法：“預(yù)接觸〞和“超數(shù)排卵〞?！邦A(yù)接觸〞：在交配前2d，將1只雄鼠放入5cm×5cm×5em的封閉柵欄筐中，把筐放在裝有8只雌鼠的鼠籠。雌鼠和雄鼠這樣生活2d，第3d晚放出雄鼠，雌雄交配。“超數(shù)排卵〞(superovulation)：用孕馬血清促性腺激素(PMSG)，結(jié)合人絨毛膜促性腺激素(HCG)進(jìn)展，中午12：00點(diǎn)向雌鼠腹腔注射PMSG10U，48h后再腹腔注射HCG10U，當(dāng)天晚8o0點(diǎn)與雄鼠1：1合籠.我們通常將裸鼠的裸基因〔nu〕導(dǎo)入C57BL小鼠過(guò)雜交，互交，回交的方式來(lái)獲得大批量的裸鼠。但由于其繁殖能力低給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究帶來(lái)了極大的困難。存在的問(wèn)題：不能很好把握好小鼠性周期四個(gè)時(shí)期的特征及確認(rèn)性周期的動(dòng)情期,從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷有一定的影響.但其繁殖率較低，給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究帶來(lái)了困難。解決問(wèn)題的思路：通過(guò)產(chǎn)仔成活率來(lái)判斷其繁殖性能,采用陰道涂片及陰道的檢查的方法,判斷其動(dòng)情期,用來(lái)指導(dǎo)其動(dòng)物交配觀察其產(chǎn)仔成活的數(shù)量,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考文獻(xiàn)[1]郝榮耀．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)．：第二軍醫(yī)大學(xué)，1999．93[2]管原七郎(原著)，志超等(譯)．哺育動(dòng)物發(fā)育工程實(shí)驗(yàn)方法．：大學(xué)1992．71～77．[3]袁伯俊，王治喬．新藥l臨床前平安性評(píng)價(jià)與實(shí)踐、：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)，1997．128132[4]文書，鐘欣，邱立明．低濕度對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠繁殖的影響．贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，3：358．[5]敬方．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)．：人民衛(wèi)生，2001．174．ObservationandStudyontheProductiveCapacityofC57BL／6MouseZHANGJian，WU*ian—jin，MaLan，HUHao，QUANQing-li。(1．BiotechnologyDepartment，HuaihuaUniversity，Htmihua，418008，China)(2、MonzwlonalAntibodyTechnologyCenterofYunnanUniversity，Kunming，650091，China)Abstract：Toimprovetherateoffertilization，theproductivecapacityofC57BL／6mousewasstudiedandtheresultsshowedthatitwasimportanttocharacterizetheestmsamongse*ualcycles．Thequalityofzygotesobtainedbynatural二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案〔實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目標(biāo),擬解決的主要問(wèn)題,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)專業(yè)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)，可行性分析,預(yù)期結(jié)果，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)工作時(shí)間安排〕〔一〕實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目標(biāo)，擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題設(shè)計(jì)目標(biāo):通過(guò)對(duì)C57BL／6小鼠的繁殖性能的研究,找出影響其受孕率上下的主要因素,從而用來(lái)指導(dǎo)其育種繁殖.提高產(chǎn)仔成活率.擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題:怎樣把握好小鼠性周期的特征,準(zhǔn)確確認(rèn)性周期的動(dòng)情期〔二〕實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì)〔遺傳背景，微生物學(xué)質(zhì)量，育種繁殖，飼養(yǎng)管理，動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)技術(shù)〕1.1遺傳背景:1921年Little用AbbyLathrop的小鼠株，近親交配，育成數(shù)個(gè)近交系動(dòng)物，以57號(hào)雌鼠與52號(hào)雄鼠交配為起源者標(biāo)為cc，中毛色固定為巧克力色者稱為CBR；毛色固定為黑色者稱為cBL，其亞系有CBL／6、C7BL／6J、C57BL／6N等。C57BL／6對(duì)Graftfi白血球因子較敏感，腫瘤自發(fā)率較低約為60%，細(xì)胞免疫力隨增齡較前降低，繁殖率較低1.2微生物學(xué)質(zhì)量:清潔級(jí)(CLA)C57BL/6小鼠，雌雄各半1.3C57BL／6小鼠繁殖方法:近交繁殖，初始動(dòng)物的選擇：挑選一對(duì)或幾對(duì)具有育種目標(biāo)要求的性狀的全同胞兄妹性別鑒定：1、雄鼠的生殖器距肛門較遠(yuǎn)2、雄鼠生殖器與肛門之間長(zhǎng)毛3、雄鼠的生殖器較雌鼠大4、雌鼠乳頭較雄鼠明顯性成熟期:35-55日齡；實(shí)配年齡：60日齡左右；成熟時(shí)體重：20克以上發(fā)情鑒定:看雌鼠外陰和陰道口，當(dāng)外陰充血腫脹、陰道口開(kāi)且呈枯燥狀態(tài)，可確認(rèn)為動(dòng)情期雌鼠。同時(shí)可作陰道涂片觀察，涂片上有大量角化上皮細(xì)胞和少量有核上皮細(xì)胞，細(xì)胞分散未成團(tuán)成堆，即為動(dòng)情期雌鼠。配種：動(dòng)情前期交配交配形式:近親繁殖〔全同胞兄妹交配〕妊娠診斷：摸胎法、陰道涂片法、外形涂片法、直腸檢查法育種代數(shù)：作為親本的全同胞兄妹〔初始動(dòng)物〕記為0代，按雌雄1：1進(jìn)展交配，所生后代記為第1代，從中又選留滿意的一對(duì)或幾對(duì)全同胞兄妹作親本，按雌雄1：1進(jìn)展交配，以此類推，直到20代以上個(gè)體選擇：選擇留繁殖力強(qiáng)，生活力強(qiáng),目標(biāo)形狀優(yōu)良的個(gè)體保種方法：修飾平行線系統(tǒng)擴(kuò)大繁殖生產(chǎn)方法：交通信號(hào)燈方法1.4飼養(yǎng)管理:C57BL／6小鼠的飼養(yǎng)應(yīng)在開(kāi)放系統(tǒng)的動(dòng)物房進(jìn)展,由于光照能刺激小鼠性激素的分泌,對(duì)雌鼠性周期有一定的影響作用,因而采用12h:12h明暗光照,采用無(wú)毒塑料籠具，墊料選用具良好吸濕性、無(wú)毒性、無(wú)異味、塵埃少的材料如電刨花，一般所有的籠具、墊料、飼料、飲水等都得經(jīng)過(guò)滅菌消毒,溫度控制在20-25℃,保持鼠房空氣相對(duì)濕度45%-60%,噪音<60dB,四季都應(yīng)進(jìn)展通風(fēng)換氣,飼養(yǎng)的時(shí)候需用專用小鼠飼料,可在粉狀飼料中添加高脂牛奶,飼料中含4%-8%的粗脂肪時(shí),C57BL／62、實(shí)驗(yàn)專業(yè)設(shè)計(jì)通過(guò)光照.溫度.噪音.濕度.營(yíng)養(yǎng)等因素對(duì)小鼠性周期的影響研究,采用自然交配法與超數(shù)排卵法,確定最正確的條件,提高其受孕率,增加產(chǎn)仔成活率.3、實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)采用平均值(*)±標(biāo)準(zhǔn)差(s),兩兩組間比擬用t檢驗(yàn),各組間比擬用方差分析，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)展結(jié)果分析。4．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方法設(shè)計(jì)：小鼠小鼠實(shí)驗(yàn)組〔自然交配〕對(duì)照組〔超數(shù)排卵法交配〕觀察產(chǎn)仔數(shù)觀察產(chǎn)仔數(shù)5．實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法：5.1.C57BL／6純系小鼠的選擇:選用性成熟未交配過(guò)的小鼠進(jìn)展,雌性生育年齡60-70天,體重20-25克.雄鼠生育年齡為60-70天,體重20-30克.5.2.確認(rèn)小鼠性周期動(dòng)情期：選擇適齡雌雄小鼠，交配前查看雌鼠外陰和陰道口，當(dāng)外陰充血腫脹、陰道口開(kāi)且呈枯燥狀態(tài)，可確認(rèn)為動(dòng)情期雌鼠。同時(shí)可作陰道涂片觀察，涂片上有大量角化上皮細(xì)胞和少量有核上皮細(xì)胞，細(xì)胞分散未成團(tuán)成堆，即為動(dòng)情期雌鼠。觀察陰道涂片的組織細(xì)胞學(xué)變化和陰道口的變化情況，可確定動(dòng)情期的不同階段。5.3.動(dòng)物交配與受孕動(dòng)物的檢查：將已確定為動(dòng)情期的雌鼠分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照兩組，實(shí)驗(yàn)組采用自然交配的方式按雌雄1：1比例晚8:o0點(diǎn)合籠，次日清晨做陰道涂片和陰栓的檢查，對(duì)照組采用超數(shù)排卵法交配的方式，用孕馬血清促性腺激素(PMSG)，結(jié)合人絨毛膜促性腺激素(HCG)進(jìn)展，中午12：00點(diǎn)向雌鼠腹腔注射PMSG10U，48h后再腹腔注射HCG10U，當(dāng)天晚8o0點(diǎn)與雄鼠1：1合籠.陰道涂片檢查：鏡檢發(fā)現(xiàn)精子，則為陽(yáng)性，記為孕期0．5d。陰栓檢查：檢查雌鼠陰道有無(wú)陰栓，必要時(shí)用眼科鑷子插入陰道，撐開(kāi)陰道口，查看有無(wú)陰栓。有陰栓者確定為受孕．記為孕期0．5d。5.4.動(dòng)物交配與妊娠的識(shí)別:小鼠交配后，在雌鼠陰道口形成一種白色陰栓，外形為“Y〞字形，外表有細(xì)橫紋，“叉狀〞段連接陰道深部。小鼠陰栓一般在交配后12～24h自動(dòng)脫落。常把陰栓的有無(wú)作為判斷是否交配的重要標(biāo)志.識(shí)別小鼠是否妊娠，可通過(guò)觀察C，BL／6小鼠的動(dòng)情周期是否消失，觀察陰道粘膜的色澤、粘液性狀、陰道口徑變化情況等加以判斷.5.5.統(tǒng)計(jì)：約19-21天后產(chǎn)下幼仔觀察并統(tǒng)計(jì)其數(shù)量?！踩晨尚行苑治觯?．1此實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便,實(shí)驗(yàn)指標(biāo)易于觀察.3．2小鼠易獲得,易飼養(yǎng)〔四〕預(yù)期效果:在適宜的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，實(shí)驗(yàn)組的小鼠的受孕率較高，產(chǎn)仔率也較高〔五〕實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)工作時(shí)間安排：實(shí)驗(yàn)工程工作時(shí)間安排實(shí)驗(yàn)小鼠的選擇30min確認(rèn)小鼠的動(dòng)情周期20min小鼠交配與受孕檢查12h小鼠的妊娠繁殖19-21d三、完成實(shí)驗(yàn)的條件1、儀器設(shè)備情況：棉簽