植物細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化及其機制

植物細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化及其機制

細胞死亡是指多細胞生物在發(fā)育過程中或因某些環(huán)境因素而發(fā)生的、積極死亡的方式。它對于生物體的正常發(fā)育、自穩(wěn)平衡及多種病理過程具有極其重要的意義。細胞凋亡的概念由Kerr于1972年提出,當時用來描述某些類型細胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序,主動地結(jié)束其生命,最終脫落離體或裂解為若干凋亡小體而被其它細胞所吞噬的過程。細胞凋亡的主要特征包括:染色質(zhì)凝集、質(zhì)膜出芽、核裂解及凋亡小體的形成。在植物的發(fā)育過程和防御機制中,由基因控制的細胞凋亡也發(fā)揮著重要作用。近年來,越來越多的證據(jù)表明,無論是在植物的生長發(fā)育過程(包括根冠細胞、導(dǎo)管分子、絨氈層細胞、大孢子細胞等),還是在超敏反應(yīng)(hypersensitivereaction)中,都普遍存在著細胞凋亡現(xiàn)象。其中,管狀分子(如導(dǎo)管和篩管)的研究一直是關(guān)注的重點。導(dǎo)管和篩管是植物體內(nèi)輸導(dǎo)組織的主要成分,負責(zé)水分、無機鹽和有機物質(zhì)的輸送。有關(guān)導(dǎo)管和篩管發(fā)育的形態(tài)學(xué)資料非常豐富,尤其是導(dǎo)管,已經(jīng)成為研究植物細胞凋亡的模式材料。目前已經(jīng)分離了2個編碼半胱氨酸蛋白酶的cDNAs、p48h-17和ZCP4,以及與DNA斷裂有關(guān)的核酸酶的cDNA克隆BEN1和ZEN1。可以說,導(dǎo)管細胞凋亡的證據(jù)已經(jīng)非常充分,但其信號傳導(dǎo)通路正在研究中。有關(guān)篩管細胞凋亡的探討目前僅停留在形態(tài)學(xué)觀察上,雖然篩管的發(fā)育過程呈現(xiàn)了細胞凋亡的典型特征,如染色質(zhì)凝集和邊緣化、核膜破毀、大量膜泡出現(xiàn)等,但少量細胞質(zhì)(線粒體和質(zhì)體)的保留體現(xiàn)了篩管的發(fā)育不同于導(dǎo)管,具有其特有的凋亡途徑。導(dǎo)管和篩管的不同凋亡途徑與其所執(zhí)行的生理功能密切相關(guān),了解和研究管狀分子分化過程中的細胞凋亡現(xiàn)象及其信號傳導(dǎo)途徑對進一步闡明細胞凋亡的機制以及在發(fā)育生物學(xué)中的作用具有非常重要的意義。本文對植物細胞凋亡的形態(tài)特征和機制進行綜述,著重闡述管狀分子發(fā)育中細胞凋亡的研究現(xiàn)狀和進展,并對兩種管狀分子(導(dǎo)管、篩管)的凋亡機制進行探討,為進一步闡明植物細胞凋亡的機制提供理論基礎(chǔ)。1植物細胞凋亡動物細胞凋亡的形態(tài)特征包括以下3個細胞學(xué)標準:(1)核內(nèi)DNA斷裂和染色質(zhì)的凝集;(2)出現(xiàn)凋亡小體;(3)凋亡小體的吞噬。植物細胞凋亡的形態(tài)有部分與動物相似,如細胞核和細胞質(zhì)的凝集和固縮,核內(nèi)DNA的片斷化通?？梢燥@示TUNEL陽性反應(yīng)和DNA梯狀條帶(DNAladder)等。但這3條標準并不能完全反映植物中的細胞死亡現(xiàn)象,如植物細胞中鮮有凋亡小體發(fā)現(xiàn)。在鋁誘導(dǎo)的大麥根冠細胞的死亡以及導(dǎo)管發(fā)育過程中,均未發(fā)現(xiàn)凋亡小體的形成。植物與動物細胞凋亡最明顯的不同在于細胞死亡后產(chǎn)物的去向,動物中都是被鄰近的細胞所吞噬,植物的機制可能涉及細胞自溶,或者用于本身細胞壁的構(gòu)建?？傊?植物細胞凋亡具有染色質(zhì)固縮和邊緣化、DNA片斷化、核的降解、細胞質(zhì)的改變包括質(zhì)膜內(nèi)縮、大量囊泡的出現(xiàn)、細胞壁的修飾等特征。2細胞凋亡parp和細胞色素c動物細胞中的凋亡通路是一個復(fù)雜的過程,簡單說有兩種主要途徑。一種是細胞表面死亡受體接受死亡信號后形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物,而使細胞凋亡的起始者(caspase2,8,9,10)活化,再激活下游的執(zhí)行者(caspase3,6,7),從而執(zhí)行對死亡底物的酶解;另一種與線粒體中細胞色素C有關(guān),細胞色素C從線粒體到胞質(zhì)的釋放是通過Bcl-2蛋白家族調(diào)控的。釋放的細胞色素C與胞質(zhì)中的dATP和Apaf-1結(jié)合,誘導(dǎo)caspase9的活化,從而引起細胞內(nèi)關(guān)鍵底物的裂解(如PARP),直接導(dǎo)致上述細胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化(圖1)。植物細胞凋亡機制的研究起步較晚,雖然與動物細胞凋亡相比具有一定的相似性,但是許多證據(jù)表明,植物細胞凋亡的相關(guān)基因和蛋白質(zhì)序列與動物細胞相比,只存在部分同源性,這也是目前植物細胞凋亡機制研究的熱點。關(guān)于植物細胞凋亡機制的研究現(xiàn)狀可以歸納為以下兩個方面。2.1植物細胞中caspase的結(jié)構(gòu)及功能變化動物細胞的凋亡是由一系列特異的半胱氨酸蛋白酶(caspase)調(diào)控的,已有證據(jù)表明植物細胞凋亡過程中也發(fā)生類似caspase的活化。Olga等用caspase特異性抑制劑Ac-YVAD-CMK(caspase-1抑制劑)和Ac-DEVD-CHO(caspase-3抑制劑)消除了煙草的細胞凋亡,第一次在細菌誘導(dǎo)的煙草細胞中檢測到類似caspase的活性,表明caspase的活化對細胞死亡起了重要的作用。Anke等在化學(xué)物質(zhì)喜樹堿、星形孢菌素、串珠鐮孢菌素誘導(dǎo)的番茄懸浮細胞凋亡中也發(fā)現(xiàn)了caspase-1和3的活性。植物細胞中有兩類caspase:液泡處理酶(VPE)和準半胱氨酸蛋白酶(metacaspase),這兩種蛋白酶的序列和三級結(jié)構(gòu)與動物的caspase有關(guān),并且具有caspase活性,被認為是caspase的同源物。VPE是一種重要的液泡處理酶,它能夠激活各種液泡蛋白酶,也能使水解酶活化,從而參與液泡的水解。VPE不僅具有caspase-1的活性,而且它的預(yù)測三級結(jié)構(gòu)也與動物的caspase-8類似,可能是植物中“液泡引發(fā)凋亡”模式的關(guān)鍵酶。而metacaspase在系統(tǒng)發(fā)生上則具有與caspase更近的同源性,根據(jù)其序列和結(jié)構(gòu)特征又分為兩種類型:Ⅰ型metacaspases含有富含脯氨酸和鋅指結(jié)構(gòu)的原結(jié)構(gòu)域,與植物HR蛋白LSD1相似;Ⅱ型metacaspase沒有明顯的原結(jié)構(gòu)域,但是在caspasep20和caspasep10亞基的中間區(qū)域具有一段180個氨基酸的保守插入序列。Frank等利用BLAST分析鑒定了番茄細胞中存在Ⅱ型metacaspaseLeMCA1,并且發(fā)現(xiàn)在真菌誘導(dǎo)的番茄葉片細胞凋亡過程中,LeMCA1mRNA的含量顯著增加。而在植物胚胎發(fā)生的末期,分化細胞中的metacaspasemcⅡ-Pa從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核,并位于核孔復(fù)合體和染色體上,引起核膜解體和DNA片斷化,說明mcⅡ-Pa是胚胎發(fā)育過程中細胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。而Moonil等用26S蛋白酶基因沉默的方法誘導(dǎo)煙草細胞凋亡時發(fā)現(xiàn),細胞不僅呈現(xiàn)了核凝集、DNA片斷化、活性氧分子大量產(chǎn)生等典型的細胞凋亡特征,而且還檢測到了類似caspase-3和caspase-9的活性,以及線粒體膜勢下降的現(xiàn)象。此外,除了VPE和metacaspase外,絲氨酸蛋白酶也呈現(xiàn)了caspase活性,可能在植物細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。2.2細胞色素c從土地釋放到胞質(zhì)動物細胞凋亡過程中,細胞色素C由線粒體向細胞質(zhì)中釋放,是caspase-3活化的必要條件。近年來,人們發(fā)現(xiàn)在凋亡誘導(dǎo)因子作用下,植物的線粒體也能釋放出細胞色素C,表明這條死亡途徑在進化過程中是保守的。Sun等首次利用無細胞體系,在甲萘醌誘導(dǎo)的煙草原質(zhì)體凋亡過程中,發(fā)現(xiàn)細胞色素C從線粒體釋放到胞質(zhì)中。他們用含有線粒體或細胞色素C的煙草細胞質(zhì)抽提物成功誘導(dǎo)了小鼠肝細胞核的凋亡以及PARP的降解;而當煙草細胞質(zhì)抽提物中不含有線粒體時,甲萘醌則不能誘導(dǎo)小鼠肝細胞核的凋亡。這說明,細胞色素C從線粒體到細胞質(zhì)中的釋放是植物細胞凋亡的必經(jīng)之路。之后,Balk等也發(fā)現(xiàn)55℃熱處理后的黃瓜子葉細胞凋亡過程中,細胞色素C從線粒體釋放到胞質(zhì)中。細胞色素C從線粒體釋放到胞質(zhì)中對于植物細胞凋亡有著重要作用,也證明了植物細胞凋亡過程中細胞色素C角色的保守性。3細胞凋亡的分子鑒定植物體的整個發(fā)育過程中許多細胞都發(fā)生凋亡,它們的凋亡對植物的發(fā)育具有不可替代的重要意義。細胞凋亡最好的例證就是植物體中運輸水分、無機鹽和有機物質(zhì)的管狀分子的發(fā)育成熟過程。有關(guān)導(dǎo)管分子分化過程中細胞凋亡的研究工作已很多,并鑒定出了與其DNA斷裂有關(guān)的DNase及其基因BEN1和ZEN1,此外,在百日菊葉肉培養(yǎng)系統(tǒng)中還克隆了管狀分子分化中特異表達的TED1至TED4等基因,說明這些基因都參與了木質(zhì)部分子分化中細胞凋亡的調(diào)控。篩管分子成熟后成為無核的半死狀態(tài)的細胞,越來越多的形態(tài)學(xué)證據(jù)(如細胞核降解、染色質(zhì)凝集等)已證明,篩管也已經(jīng)具備了細胞凋亡的基本形態(tài)特征,但目前仍缺乏分子學(xué)佐證。值得注意的是,管狀分子如導(dǎo)管、篩管在其發(fā)育、分化和執(zhí)行生理功能中所特有的凋亡過程雖然有其共同的特點,但在超微結(jié)構(gòu)和凋亡機制等方面存在一定的差異。3.1成熟導(dǎo)管喪失原理植物細胞凋亡的最典型例子就是木質(zhì)部導(dǎo)管分子的分化。導(dǎo)管分子是木質(zhì)部的典型細胞,成熟導(dǎo)管喪失了核和細胞內(nèi)容物,只剩下一個中空的管道。從分生組織到成熟導(dǎo)管,導(dǎo)管的分化經(jīng)歷了原形成層起始物、原形成層、不成熟的導(dǎo)管和導(dǎo)管前體4個階段,細胞凋亡發(fā)生在導(dǎo)管成熟階段。3.1.1細胞破壁與細胞外細胞的降解在原生木質(zhì)部形成過程中,導(dǎo)管細胞經(jīng)歷了形態(tài)和生理變化。首先,隨著原形成層的分生組織細胞的伸長,細胞壁形成環(huán)紋、螺紋或網(wǎng)紋的加厚。在次生壁加厚的同時,細胞骨架發(fā)生重排,高爾基體增多。隨后細胞開始自溶,大量細胞內(nèi)容物,包括質(zhì)體、高爾基體、線粒體、微管、核糖體、溶酶體、質(zhì)膜以及細胞核等都隨著液泡的裂解而消失。在導(dǎo)管細胞的分化過程中,細胞核的結(jié)構(gòu)和DNA含量均發(fā)生明顯變化。在早期,細胞核體積膨大,DNA含量增加;當次生壁形成以后,細胞核體積開始縮小,并且出現(xiàn)一些結(jié)構(gòu)變化,包括形成葉狀突起、染色質(zhì)凝集等;最后,核仁消失,核質(zhì)不易被著色。Mittler等利用DNA斷裂原位雜交的方法,證明在導(dǎo)管細胞核解體之前,核內(nèi)DNA發(fā)生斷裂,且證明DNA的降解發(fā)生在細胞核破裂之前,表明核酸內(nèi)切酶活化的機制可能導(dǎo)致了植物細胞核內(nèi)DNA的降解。另外,細胞降解過程中細胞質(zhì)出現(xiàn)球狀小體,將細胞質(zhì)成分運送到液泡中降解。該過程與動物細胞凋亡小體形成過程相似,唯一不同的是動物細胞的凋亡小體通過質(zhì)膜出芽,最終被鄰近細胞所吞噬,而不是進入液泡中降解。體外培養(yǎng)的導(dǎo)管細胞與植物體內(nèi)木質(zhì)部的導(dǎo)管分子的細胞凋亡不盡相同,并無球狀小體的出現(xiàn)。在體外培養(yǎng)的百日菊細胞中,所有細胞器包括核的降解,都發(fā)生在液泡裂解之后,說明液泡破裂是細胞器降解的最早標志。液泡裂解后,單膜細胞器,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體首先發(fā)生末端膨脹,變成氣球狀結(jié)構(gòu),然后消失。不久雙層膜細胞器如葉綠體、線粒體開始降解,先是基質(zhì),然后是膜。熒光染色結(jié)果表明在液泡破裂后10~20min內(nèi),細胞核迅速降解,沒有染色質(zhì)凝集和DNA斷裂現(xiàn)象出現(xiàn),且葉綠體中的核酸與細胞核中的核酸幾乎同時降解。無論是體外培養(yǎng)的導(dǎo)管細胞還是木質(zhì)部的導(dǎo)管,液泡在分化過程中都起著舉足輕重的作用,類似于動物細胞的溶酶體。這也是植物細胞凋亡不同于動物細胞凋亡的顯著特征。3.1.2液泡裂解前細胞的活性與動物細胞凋亡不同,導(dǎo)管具有其獨特的凋亡模式。導(dǎo)管細胞凋亡最明顯的特征就是中央大液泡的迅速裂解釋放出多種蛋白酶和核酸酶,導(dǎo)致各種細胞器,包括細胞核的最終降解(圖2)。對百日菊細胞的顯微觀察表明,導(dǎo)管分化過程中,先發(fā)生次生壁的加厚,然后出現(xiàn)液泡裂解,之后細胞內(nèi)容物消失。在次生壁加厚的過程中,胞質(zhì)仍然流動,液泡裂解的同時,胞質(zhì)停止流動,表明液泡裂解前細胞仍然具有活性。導(dǎo)管細胞凋亡涉及2種酶參與。一方面,液泡裂解導(dǎo)致最適pH為酸性水解酶(包括核酸酶和蛋白酶)的釋放,去攻擊各種細胞器。ZEN1是一種S1型Zn2+依賴的核酸酶,是第一個被分離和鑒定的液泡酶,對核DNA降解起著主要作用。ZENl是一個43kD的核酸酶,由303個氨基酸殘基組成,推測含有1個25個氨基酸殘基的信號肽,酸性pH條件下可促進ZEN1的活性。大麥液泡中的天冬氨酸蛋白酶(phytepsin)以及類似木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶也在導(dǎo)管形成過程中高度表達,且也有酸性的pH。這些結(jié)果表明,液泡通過積累多種凋亡特異性的酸性水解酶來行使其裂解功能,類似于動物細胞凋亡中溶酶體的作用。除此之外,在液泡裂解所引發(fā)的細胞自溶之前,細胞質(zhì)中還存在另外一個與中性pH絲氨酸蛋白酶相關(guān)的凋亡途徑。3.2篩管-伴胞復(fù)合體的運輸路線篩管是由許多篩管分子(篩管細胞、篩管節(jié))上下連接形成的管狀結(jié)構(gòu),是同化物運輸?shù)闹饕ǖ?。篩管分子是活細胞,旁邊具有與之同源的伴胞,伴胞有核,細胞質(zhì)濃厚,具有全套的細胞器,與篩管細胞配對存在,組成篩管-伴胞復(fù)合體(sieve-element-companion,SE-CC),它們之間通過胞間連絲進行各種物質(zhì)包括代謝物和生物大分子的運輸。篩管位于同化物裝載途徑中的關(guān)鍵位置,大部分光合細胞形成的光合產(chǎn)物首先通過胞間連絲進入鄰近SE-CC復(fù)合體的光合細胞,然后釋放到質(zhì)外體,在進入SE-CC復(fù)合體中的伴胞,通過與質(zhì)子的協(xié)同運輸,最終進入篩管分子進行長距離運輸。早期的篩管超微結(jié)構(gòu)顯示,篩管分子發(fā)育過程呈現(xiàn)了典型的細胞凋亡現(xiàn)象,但與導(dǎo)管分子不同,成熟的篩管分子保留了少數(shù)細胞器,仍具有生理活性。3.2.1甲殼動物分子發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)變化(1)篩孔形成期k由于篩管承載了很高的水勢,這就要求篩管細胞壁必須經(jīng)過一定的修飾才能避免爆裂。在篩分子分化早期,細胞膜附近出現(xiàn)大量與細胞縱軸呈一定角度的微管,纖維素維纖絲被微管環(huán)繞,形成筒-環(huán)結(jié)構(gòu)。隨著篩分子的成熟,微管逐漸降解,最后完全消失。此外,篩分子成熟的重要標志之一是篩孔的形成。篩孔的形成與胼胝質(zhì)的沉積有關(guān),但發(fā)育成熟時,沉積在端壁上的胼胝質(zhì)被降解,形成中空的孔道,即篩孔。(2)篩管分子早期分化和功能發(fā)揮著作用在篩管分子發(fā)育過程中,細胞核、液泡、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等逐漸被降解,形成一個近中空的管道。首先細胞核作為有界膜的實體消失了,因此篩管分子失去了生長、轉(zhuǎn)化和分裂的能力。1986年,E1eftherious以小麥根尖為材料,研究原生韌皮部篩管細胞的分化過程中,首次報道了細胞核的解體過程,即隨著篩管細胞的伸長,細胞核縱向拉伸,染色質(zhì)在核的邊緣聚集,并形成高電子密度的團塊,在染色質(zhì)聚集部位的外層核膜膨大,核間隙明顯增大,最后細胞核形成葉狀突起,連同包在其中的染色質(zhì)團塊與細胞核主體分離。這一過程與動物細胞凋亡的過程頗為類似。吳鴻等觀察了擬南芥根原生韌皮部篩管分子在發(fā)育過程中的超微結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果表明,細胞核具有細胞凋亡的典型特征:出現(xiàn)核膜內(nèi)陷、核質(zhì)聚集并邊緣化、核膜破毀以及最后核消失。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失去核糖體成為特殊的篩管內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(sieveelementreticulum,SER),并聚集成堆,當篩管分子成熟時,只在細胞周圍有少量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在。SER也是篩管分子成熟的重要標志之一,SER的作用目前尚不清楚,但有證據(jù)表明,在液泡裂解以后,SER可以作為貯藏Ca2+的場所。液泡在發(fā)育后期也發(fā)生降解,釋放出各種蛋白水解酶,這些水解酶可能與細胞器的降解有關(guān),但蛋白酶的選擇性水解機制至今還不清楚。雖然大多數(shù)細胞器在篩管分化過程都消失了,但仍有少量細胞器如線粒體和質(zhì)體被保留下來。成熟篩管的質(zhì)體缺乏類囊體膜,只包含結(jié)晶狀蛋白質(zhì)或淀粉粒,這些