四逆湯中藥附子和甘草配伍前后主要成分含量變化

四逆湯中藥附子和甘草配伍前后主要成分含量變化

四逆湯（sd）源于張仲景的《傷寒論》。這是治療感冒和少陰寒虛證的代表處方。主要用于少陰病、四肢怕冷、下樂清谷、脈搏細(xì)、虛弱等疾病。在既往的研究發(fā)現(xiàn),SD對(duì)冠心病心肌缺血具有良好的保護(hù)作用,本研究在此基礎(chǔ)上,以SD方藥為研究對(duì)象,從方藥配伍的君、臣、佐、使關(guān)系出發(fā),以君藥附子為核心,對(duì)其中藥味附子、甘草組成的方藥進(jìn)行藥物成分定性定量相關(guān)性分析,對(duì)SD方藥中主要藥味配伍進(jìn)行規(guī)律性的研究。1中藥來源API-365電噴霧離子化-質(zhì)譜質(zhì)譜(ESI-MS/MS)聯(lián)用儀(Perkinelmer-SCIEX公司);Waters公司高效液相色譜儀,486檢測(cè)器,510泵,810色譜工作站;日本島津CS-930型雙波長薄層掃描儀。中藥來源:附子(黑順片)(AconitiumcarmichaeliDebx.)、甘草(GlycyrrhizaeuralensisFisch)、干姜(ZingiberofficinaleRosc.)(均購于廣州藥材公司,經(jīng)廣州中藥大學(xué)藥鑒教研室鑒定);甘草浸膏用上述甘草原藥材自制;甘草酸單銨鹽對(duì)照品(中國藥品生物檢定所);硅膠GF254(青島海洋化工廠);其他化學(xué)試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1附子甘草、甘草的制備分別稱取附子(50g),附子(50g)+甘草(20g),附子(50g),甘草(20g),于4個(gè)燒杯中,加入8倍量的水,水浴煮沸2h,過濾,濾液濃縮,醇沉,取醇層,回收乙醇將附子及甘草煎劑混合,上述方法形成附子單煎劑,附子與甘草的合煎劑以及附子甘草單煎后再混合,此三種溶液均以附子量定容至1:1,得供試液,備用。各取供試液5ml,用氨水調(diào)pH值等于9,溶液用乙醚提取2次,每次10ml,揮干,渣用少量二氯甲烷溶解,移入1ml容量瓶中,加二氯甲烷至刻度,搖勻,備用。2.2氯甲烷溶液精密稱取烏頭堿2.0mg,次烏頭堿2.3mg,新烏頭堿1.5mg,置小燒杯中,加入二氯甲烷溶解后,移入10ml容量瓶中,加入二氯甲烷至刻度搖勻,即得。2.3定性分析2.3.1薄層板上的用將上述點(diǎn)樣液各取10μl,點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上。用氯仿:甲醇(9:1)為展開系統(tǒng),加適量的氨水飽和展開缸,上行展開,展距13~15cm,碘蒸氣為顯色劑進(jìn)行顯色。2.3.2甘草的薄層分析各取供試液各10μl,點(diǎn)于同一塊硅膠GF254薄層板上,用正丁醇:冰醋酸:水(6:1:3)為展開系統(tǒng)。紫外燈下顯色。2.4定量分析2.4.1對(duì)照品掃碼,確定所測(cè)分子中分子量掃描方式:Q1掃描(ESI/MS)正離子;Q3掃描分解CID譜。樣品處理:取Tab1中的方藥2ml,用等量的甲醇稀釋,過濾后,用水稀釋10倍,直接用spring泵進(jìn)樣,30μl/min,計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理。用對(duì)照品掃描確定所測(cè)化學(xué)成分的離子峰,得到分子量值及順序信息。MS/MS分析:用串聯(lián)質(zhì)譜ESI-MS/MS將對(duì)照品及各樣品溶液進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表1。2.4.2甘草酸含量測(cè)定測(cè)試樣品的制備:4002g(相當(dāng)于甘草原生藥量2.5g)用50%乙醇適量充分溶解,濾過,棄去沉淀,用50%乙醇定容50ml,得甘草酸樣品液。取上述批號(hào)甘草浸膏等量,按比例(附子:甘草=5:2)與附子醇沉液合并,回收乙醇后,用50%乙醇定容50ml得配伍樣品液Ⅰ和Ⅱ。樣品測(cè)定:分別準(zhǔn)確吸取各樣品液4μl和甘草酸標(biāo)準(zhǔn)液8μl,分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上按2.3法展開,定位掃描測(cè)定,記錄吸收度積分值。外標(biāo)一點(diǎn)法定量,測(cè)得各樣品液甘草酸含量,并將此成分與附子醇溶液合并后定容,與單純的甘草的體積相同。結(jié)果見表2。3附子與甘草配伍的穩(wěn)定性3.1從薄層色譜圖1可以看出,附子,附子+甘草,附子、甘草混合提取不同的配伍后附子的主要成分烏頭堿、次烏頭堿均存在,但可能含量上有所變化。從薄層色譜圖2可以看出,甘草、附子+甘草以及單獨(dú)提取后再混合,其甘草的主要成分甘草酸及次甘劃酸的成份均存在。3.2從表1可知,附子甘草合煎劑、附子、甘草單獨(dú)提取后再混合,其中烏頭類生物堿的含量顯著降低。且附子中烏頭堿的穩(wěn)定性相對(duì)差些,說明兩味藥物相互作用可能產(chǎn)生不溶性的物質(zhì)(因?yàn)闉躅^堿與甘草中的甘草酸可能形成絡(luò)合物)從而減少烏頭堿、次烏頭堿的含量。從表2可知,附子與甘草配伍后甘草酸的含量也有所降低。其原因與上述原因相同,是附子與甘草的有關(guān)成分在一起形成不溶性的沉淀形成絡(luò)合物,從而降低其含量,用薄層色譜對(duì)兩藥配伍以后甘草酸的含量也發(fā)生變化,其減少的劑量與烏頭堿類生物堿一致。通過比較研究我們可以發(fā)現(xiàn),附子與甘草兩藥在配伍使用時(shí)較佳的方法為先單煎然后再混合為佳。從附子、甘草所含成分在同煎可能會(huì)發(fā)生絡(luò)合作用,生成絡(luò)合物,形成沉淀,而被濾出。但其絡(luò)合物在進(jìn)入消化道以后可以在胃酸中或酶的作用下絡(luò)合物可以發(fā)揮生理作用效應(yīng)。還可能增加療效,同時(shí)降低附子中烏頭堿的毒副作用。筆者曾做過相關(guān)的藥理實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,單味藥物的作用遠(yuǎn)不及藥味之間的配伍運(yùn)用。分析其機(jī)制可能是由于生物堿與甘草酸所產(chǎn)生的沉淀在體內(nèi)的環(huán)境中會(huì)緩慢地釋放,從而維持其血藥濃度。難怪在中藥經(jīng)典復(fù)