雞蛋雞蛋中溶菌酶含量和活力的測(cè)定

雞蛋雞蛋中溶菌酶含量和活力的測(cè)定

溶菌酶是一種能夠通過(guò)分析細(xì)胞膜成分中的n-羥色胺和n-羥色胺-1.4糖苷鍵的酶。廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品工業(yè)、生物工程等領(lǐng)域?，F(xiàn)在，從雞蛋和蛋黃花中提取的溶菌酶達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)水平。蛋清中的溶菌酶含量越高,酶活力越強(qiáng),越有利于雞蛋的保存,因此測(cè)定雞蛋蛋清中的溶菌酶對(duì)我國(guó)溶菌酶生產(chǎn)、禽蛋產(chǎn)品加工有重要的指導(dǎo)作用,也為蛋品質(zhì)評(píng)定提供了一個(gè)重要參數(shù)。對(duì)溶菌酶的研究始于20世紀(jì)初,英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明在1922年發(fā)現(xiàn)人的鼻涕、唾液、眼淚有強(qiáng)大的溶菌活性,并把其溶菌作用的因子命名為溶菌酶。此后研究者在人和動(dòng)物的多種組織、分泌液及某些植物、微生物中也發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在,其中雞蛋蛋清的溶菌酶含量最高(約含0.3%)。雞蛋蛋清已成為溶菌酶生產(chǎn)的主要原料,但是蛋清中溶菌酶的定量測(cè)定還沒(méi)有一個(gè)較便捷的方法,傳統(tǒng)的方法是先提取蛋清中的溶菌酶,再測(cè)定提取液中的蛋白含量。由于不可能完全提取出蛋清中的溶菌酶,這種方法計(jì)算出的蛋清溶菌酶含量往往比實(shí)際的數(shù)值小。溶菌酶活力的測(cè)定方法很多,目前,國(guó)內(nèi)常用的有瓊脂板擴(kuò)散法、比色法、高效液相色譜法等,而國(guó)外多用比濁法測(cè)定溶菌酶活力。本研究在比濁法的基礎(chǔ)上,針對(duì)雞蛋蛋清中溶菌酶的含量和活力設(shè)計(jì)出一套系統(tǒng)的測(cè)定方法,為蛋清中的溶菌酶測(cè)定提供一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法,規(guī)范我國(guó)禽蛋中溶菌酶的測(cè)定。1材料和方法1.1溶壁微菌種m.lysodeimctus雞蛋蛋清溶菌酶(20000U/mg)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;溶壁微球菌(M.Lysodeikticus)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,菌種編號(hào)1.634;其他試劑均為分析純級(jí)。1.2有關(guān)溶解酶含量的測(cè)定1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制溶菌酶用0.9%氯化鈉稀釋成不同梯度濃度(0、0.2、0.4、0.8、1mg/mL),以溶菌酶工作液濃度為橫坐標(biāo),281nm波長(zhǎng)處吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求出回歸方程。1.2.1浴5天時(shí)析蛋清用0.9%氯化鈉稀釋,乙酸調(diào)溶液至pH4.5,77℃水浴10min后取出,靜置1h。離心取上清,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作測(cè)得OD281值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算蛋清溶液中溶菌酶的含量(C),再乘以稀釋倍數(shù)即為蛋清中溶菌酶的含量(P)。1.3內(nèi)酶活性測(cè)定1.3.1用0.2mol/ml代替產(chǎn)生的溶壁微生物1.3.2血清中每嫌犯總a、b將蛋清溶液、菌液于25℃水浴中保溫,反應(yīng)體系見(jiàn)表1。記下反應(yīng)15s和75s時(shí)的讀數(shù)A1、A2。按每分鐘OD450值下降0.001為1個(gè)活力單位(U)的定義,蛋清中每毫克溶菌酶的活力用以下公式計(jì)算:式中,△E450為450nm波長(zhǎng)處吸光度A1、A2之差;C為蛋清溶液中溶菌酶的含量(μg/mL)。1.4準(zhǔn)確度、精度和開(kāi)口1.5重復(fù)試驗(yàn)1.6伊薩蛋和京海黃蛋中的溶菌酶測(cè)定1.7統(tǒng)計(jì)分析用軟件SPSS11.0統(tǒng)計(jì)各指標(biāo)均值和方差,并運(yùn)用GLM程序的方差分析對(duì)伊薩雞蛋和京海黃雞蛋蛋清溶菌酶含量和活力進(jìn)行比較。2結(jié)果與分析2.1溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線溶菌酶溶解后經(jīng)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè),在281nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)峰值。配制不同梯度濃度溶菌酶溶液,每毫升溶液中的溶菌酶含量與281nm波長(zhǎng)處吸光度呈線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線圖形見(jiàn)圖1,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=2.4429X+0.0149,R2=0.9998。2.2綜合密度、精度和靈敏度的結(jié)果2.2.1血清中溶菌酶含量測(cè)定精密度一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD(即變異系數(shù)CV)表示,RSD越低,則表示方法精密度越好。低、中、高3種濃度(3種濃度蛋清溶液是依據(jù)稀釋倍數(shù)不同,本研究低濃度蛋清稀釋了70倍,中濃度蛋清稀釋了20倍,高濃度蛋清稀釋了10倍)的蛋清溶液中溶菌酶含量的日內(nèi)(上午、下午和晚上)和日間(不同日的同一時(shí)間)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2和表3,其中日內(nèi)RSD<3%(2.01%、2.08%、0.80%),日間RSD<4%(3.18%、2.36%、1.46%),3種濃度蛋清溶液的溶菌酶含量測(cè)定值日內(nèi)RSD均小于日間RSD。2.2.2溶菌酶測(cè)定m通過(guò)已知量溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品在蛋清溶液中的加樣回收試驗(yàn),用溶菌酶的回收率(R=(M-P)/A×100%其中,M為測(cè)得溶菌酶量;M-P為回收溶菌酶量)表示方法的準(zhǔn)確度,回收率越接近100%,表示方法準(zhǔn)確度越高。以蛋清溶液(由1.2測(cè)得P為197.35μg/mL)為溶劑配制200、400、600μg/mL溶菌酶溶液,添加回收率計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4,3種濃度溶菌酶的添加回收率都在95%以上。2.2.3測(cè)定溶菌酶含量的定量限靈敏度用最低定量濃度(定量限LOQ)和最低檢測(cè)濃度(檢測(cè)限LOD)2項(xiàng)指標(biāo)表示。配制一系列低溶菌酶濃度溶液,對(duì)每種濃度取樣4次進(jìn)行測(cè)定,定量限測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5,當(dāng)酶濃度降低到4μg/mL時(shí),相對(duì)誤差E>20%,因此本方法測(cè)定溶菌酶含量的定量限為5μg/mL。以蛋清溶液為溶劑配制一系列低濃度的溶菌酶溶液,蛋清溶液為空白調(diào)零,檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6,當(dāng)溶菌酶濃度低于0.3μg/mL時(shí),吸光度值不穩(wěn)定,因此本方法測(cè)定溶菌酶含量的檢測(cè)限為0.3μg/mL。2.3溶菌酶測(cè)定結(jié)果測(cè)定方法是否穩(wěn)定用重復(fù)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示,RSD越小,測(cè)定結(jié)果越一致,證明測(cè)定方法越穩(wěn)定。蛋清重復(fù)樣1~5的溶菌酶含量和活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。重復(fù)樣的溶菌酶含量RSD為3.03%,活力RSD為6.17%,即本方法所測(cè)蛋清溶菌酶含量和活力的RSD都小于7%。2.4蛋清溶菌酶活力2個(gè)品種雞蛋蛋清溶菌酶含量和活力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8。本試驗(yàn)所測(cè)伊薩雞蛋和京海黃雞蛋蛋清溶菌酶平均含量分別為3.47、3.71mg/mL,蛋清溶菌酶平均活力分別為16183.74、15689.35U/mg。伊薩雞蛋較重(P<0.01),蛋清溶菌酶含量顯著低于京海黃雞蛋蛋清溶菌酶含量(P<0.05);伊薩雞蛋蛋清溶菌酶活力略高于京海黃雞蛋蛋清溶菌酶活力,(P>0.05)。3討論3.1溶菌酶的提取途徑測(cè)定雞蛋蛋清中的溶菌酶含量的傳統(tǒng)途徑是先提取再測(cè)定,從蛋清中分離純化溶菌酶已有不少報(bào)道,雖然正交試驗(yàn)的酶回收率可達(dá)94%,但是再精確的提取途徑也無(wú)法完全提取出蛋清中的溶菌酶。本方法測(cè)定蛋清中的溶菌酶含量精密度(RSD<4%)、準(zhǔn)確度(R>95%)、靈敏度(LOQ5μg/mL,LOD0.3μg/mL)、可重復(fù)性(RSD<7%)均符合方法評(píng)估實(shí)驗(yàn)要求,所測(cè)2個(gè)品種雞蛋蛋清溶菌酶含量(2.93~4.07mg/mL)與相關(guān)研究結(jié)果基本一致,且本方法測(cè)定過(guò)程不涉及提取,測(cè)定周期短,對(duì)酶的活力影響小。3.2s至65s的時(shí)間酶的活力表示為特定條件下單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化底物的速度,試驗(yàn)過(guò)程中,每5s記錄1次測(cè)定管的吸光度值,在15s至75s之間測(cè)定管吸光度值以穩(wěn)定速度下降,因此單位時(shí)間選擇為15s至75s,該時(shí)間段的選擇在文獻(xiàn)中亦有描述。2個(gè)品種雞蛋蛋清溶菌酶活力測(cè)定結(jié)果(13832.54~20842.74U/mg)與以往研究一致。溶菌酶活力的測(cè)定方法很多,其中比濁法是一直沿用至今的經(jīng)典方法,本方法借鑒了前人在比濁法上的研究成果,改進(jìn)酶活力的測(cè)定條件,縮短了測(cè)定時(shí)間(1min),運(yùn)用本方法大批量、不定時(shí)測(cè)定蛋清中的溶菌酶活力時(shí),為了節(jié)省每次測(cè)定培養(yǎng)溶壁微球菌的時(shí)間,可以把培養(yǎng)好的溶壁微球菌用20%的甘油作為保護(hù)劑,放入冰箱-20℃下保存,每次測(cè)定時(shí)稱(chēng)取少許菌和甘油的混合物制成底物即可使用。4消溶酶活力測(cè)定方法本方法用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),在不需要提取溶菌酶的情況下直接測(cè)定蛋清中的溶菌酶含量,測(cè)定周期短,對(duì)酶活力影響小,方法穩(wěn)定可靠;改進(jìn)了經(jīng)典比濁法酶活力的測(cè)定條件,縮短了測(cè)定時(shí)間,尤其在大批量、不定時(shí)測(cè)定雞蛋蛋清中的溶菌酶活力時(shí),減少測(cè)定成本。本研究為家禽蛋清中溶菌酶的測(cè)定提供了一套操作性強(qiáng)、易于掌握、結(jié)果可靠穩(wěn)定的方法,本測(cè)定雞蛋蛋