第九章動物實驗質(zhì)量控制

第九章動物實驗質(zhì)量控制第九章動物實驗質(zhì)量控制第一節(jié)動物實驗質(zhì)量控制的意義動物實驗是對演出型的一種影響處置。動物對實驗處理的反應(yīng)可用如下公式表示：R=（A+B+C）?D+E。其中R表示實驗動物的總反應(yīng)，A表示動物種的共同反應(yīng)，B表示品種及品系特有的反應(yīng)，C表示動物的個體反應(yīng)（個體差異）,D表示環(huán)境影響，E表示實驗誤差。由公式可以看出：A、B、C是由實驗動物本身的遺傳因素所決定的，而D是環(huán)境因素（包括實驗處理），與動物的總反應(yīng)呈正相關(guān)，故必須盡量減少D的變化，排除實驗處理以外的影響，得到一個比較理想的實驗結(jié)果R。動物實驗是對演出型的一種影響處置。為了求得動物對處理結(jié)果的可信性和可重復性，就要求演出型的穩(wěn)定，積極控制影響動物機體的遺傳因素和環(huán)境條件。因此，對動物實驗實行質(zhì)量控制具有特別重要的意義。一、動物實驗設(shè)計中的質(zhì)量控制規(guī)劃動物實驗必須掌握學科專業(yè)知識,熟悉疾病的發(fā)病機理、臨床體征、治療用藥、疾病轉(zhuǎn)歸以及有關(guān)檢查指標等.規(guī)劃動物實驗還要較好地掌握實驗動物學的知識，做好實驗對象、處理因素和實驗效應(yīng)三個基本要素的設(shè)計。因此,成功的動物實驗則是將醫(yī)藥學和實驗動物學等學科知識有機結(jié)合，并使設(shè)計合理的課題得到正確實施的結(jié)果。在實驗對象上，應(yīng)正確選擇實驗動物，重點在遺傳因素的控制；在處理因素方面，除了施加的實驗因素和統(tǒng)計處理外，還包括實驗環(huán)境、微生物和營養(yǎng)等實驗條件的質(zhì)量控制；實驗效應(yīng)即預期實驗結(jié)果。例如研究某種終止早孕藥物的作用，實驗對象選擇早孕大鼠，處理因素則為該藥物并進行實驗條件質(zhì)量控制，而實驗效應(yīng)則為早孕終止。二、實驗動物標準化實驗動物的標準化是由實驗動物生產(chǎn)條件的標準化、動物質(zhì)量的標準化以及動物實驗（應(yīng)用）條件的標準化三部分組成。只有動物實驗條件與生產(chǎn)條件相適應(yīng)，才能保證標準化實驗動物在整個使用過程中保持其標準化的價值，才不會發(fā)生高等級動物進入低等級實驗環(huán)境中導致動物降級或降質(zhì)的現(xiàn)象．因而，實驗動物的標準化對動物實驗研究結(jié)果的敏感性、準確性及可重復性具有重要影響。實驗動物標準化與遺傳、微生物和寄生蟲、環(huán)境、營養(yǎng)等影響動物生長發(fā)育的因素關(guān)系密切，在實驗動物繁育與使用過程中必須對這些因素進行嚴格控制，以保證實驗動物和動物實驗的質(zhì)量。三、藥品安全性研究規(guī)范和標準操作規(guī)程藥品的毒性檢測和安全性評價是新藥研究開發(fā)所必須進行的基本程序。藥品的安全性評價安排在臨床研究前進行，主要采用實驗動物作預測。由于影響結(jié)果的因素比較復雜，因而要保證實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果的可靠性、可重復性和科學性，就必須對實驗動物選擇、模型建立、試驗設(shè)計與實施、檢測技術(shù)、供試品與對照品的選擇與保存、實驗工作與數(shù)據(jù)記錄、結(jié)果與結(jié)論的評價方法等作嚴格規(guī)范，對試驗的全過程進行嚴格監(jiān)督。對設(shè)施與儀器、人員配備與培訓亦須嚴格要求。因此進行藥品非臨床安全評價研究規(guī)范（goodboratorypractice,GLP）體系建設(shè)非常必要，是提高新藥研制水平、規(guī)范國際藥品市場所必需。GLP是藥物非臨床安全性研究的指導原則，是解決“做什么”的問題，而與之對應(yīng)的標準操作規(guī)程（standardoperatingprocedure,SOP）則是解決“怎么做”的問題，是保障GLP得以實現(xiàn)的具體方法和步驟。GLP管理規(guī)范已成為世界藥品安全性評價的通行標準。第二節(jié)動物實驗設(shè)計與分組一、醫(yī)學科研工作基本程序醫(yī)學科學研究就方法來說是提出假說、驗證假說的過程，其工作程序是緊緊圍繞這條主線進行的。醫(yī)學科研工作基本程序如下1.提出假說、確定題目，是戰(zhàn)略性決定。初始意念或提出問題→文獻檢索，調(diào)查訪問→假說形成，提出設(shè)想→陳述問題，開題討論．2.安排實驗，驗證假說，是戰(zhàn)術(shù)組織。實驗設(shè)計→實驗觀察→數(shù)據(jù)資料積累．3.總結(jié)工作，完成論文，是拿出戰(zhàn)果。數(shù)據(jù)資料處理→統(tǒng)計分析→提出結(jié)論。二、動物實驗設(shè)計應(yīng)遵循的原則1.對照性原則：對照性原則是要求在實驗中設(shè)立可與實驗組比較，用于消除各種無關(guān)因素影響的對照組。對照應(yīng)有可比性,即在“同時同地同條件”下進行.設(shè)立對照的正確方法是把研究對象隨機分配給對照組和實驗組.對照設(shè)立有兩種方式,即自體對照和組間對照.自體對照是指在同一個體身上觀察實驗處理前后某種指標的變化,即把實驗處理前的觀察指標,作為實驗處理后同一指標變化的對照.也可以把兩種實驗處理在同一個體身上進行一前一后地交叉比較.自體對照可有效減少個體差異對試驗處理反應(yīng)的影響.組間對照是指將若干動物以隨機抽樣的方法,將其分成若干平行組,隨機挑選一組作為實驗組,另一組作為對照組,進行比較.不作任何實驗處理或給生理鹽水進行比較的對照組稱“空白對照”或“陰性對照”；施行正常值、標準值處理進行比較的對照組稱”標準對照”或”陽性對照”.對照各組均應(yīng)在同一條件下,否則失去對照意義.組間對照適用于需要多次進行實驗觀察的實驗,有利于隨時觀察實驗條件變化,判斷試驗反應(yīng)強弱及顯著性等.實驗組與對照組例數(shù)相等時,統(tǒng)計效率最高.2.一致性原則:一致性原則是在實驗中實驗組與對照組除了處理因素不同外,非處理因素基本保證均衡一致.均衡一致是處理因素具有可比性的基礎(chǔ).為獲得可靠的實驗結(jié)果,最重要的是實驗過程中保證實驗組與對照組之間除被研究的實驗處理因素有所不同之外,實驗對象、實驗條件、實驗環(huán)境、實驗時間、藥品、儀器、設(shè)備、操作人員等等,均應(yīng)力求一致.3.重復性原則:重復性原則是指同一處理要設(shè)置多個樣本例數(shù).重復的主要作用是估計試驗誤差、降低試驗誤差和增強代表性,提高實驗結(jié)果的精確度,同時為體現(xiàn)結(jié)果的真實性,保證實驗結(jié)果能在同一個體或不同個體中穩(wěn)定地重復出來,也需要足夠的樣本數(shù).可按一般估測方法確定,也可通過統(tǒng)計學方法進行測算確定.茲介紹如下:3.1.一般估測的樣本數(shù)小動物(大鼠、小鼠、蛙、魚)每組10-30例,計量資料每組不少于10例,計數(shù)資料每組不少于30例；中等動物(豚鼠、家兔)每組8-20例,計量資料每組不少于8例,計數(shù)資料每組不少于20例；大動物(犬、貓、豬、羊等)每組6-20例,計量資料每組不少于6例,計數(shù)資料每組不少于20例.3.2按統(tǒng)計學方法測算的樣本數(shù)現(xiàn)介紹一種動物實驗的樣本含量計算公式：n=2б2(tα+tβ)2/δ2式中，n為樣本含量，б為標準差；tα取有顯著性的t分布值，t0.05=1.96；tβ為無顯著性的t分布值，1-β為實驗檢驗?zāi)芰?，動物實驗一般?-β=0.80，t0.20=0.842；δ為處理組與對照組均值間的差異，可從預實驗或文獻資料庫中獲得。由上述參數(shù)可計算出正式實驗所需樣本含量。舉例如下：給某種動物飼喂一種新型飼料，預實驗中每月體重增長比原飼料增加30±15克（均值±標準差）。設(shè)顯著水平為95%，檢驗?zāi)芰?0%，則正式實驗所需樣本含量n為：n=2×152×（1.96+0.842）2/302=3.93即每組只需4只動物。由以上公式及有關(guān)計算可知，優(yōu)化了實驗操作，使獲得的數(shù)據(jù)波動即標準差越小，實驗結(jié)果的一致性越好，要求的樣本含量就越少；處理組與對照組實驗結(jié)果間的差異即δ越大，所需樣本含量亦越少。從而有利于減少動物用量。樣本含量多少尚與統(tǒng)計顯著性相關(guān)，若提高顯著性水平和檢驗?zāi)芰Φ囊?，則所需動物數(shù)量就得增多。4.隨機性原則:隨機性原則就是按照機遇均等的原則來進行分組.其目的是使一切干擾因素造成的實驗誤差盡量減少,而不受實驗者主觀因素或其它偏性誤差的影響.隨機化的手段可采用編號卡片抽簽法、隨機數(shù)字表或采用計算器的隨機數(shù)值鍵等.5.客觀性原則:動物實驗設(shè)計中力戒主觀偏性干擾,選擇觀察指標時,不用或盡量少用帶主觀成分的指標.結(jié)果判斷要客觀,更不能以主觀的意愿對結(jié)果或數(shù)據(jù)作任意的改動和取舍.三、動物實驗設(shè)計的基本類型1.單組比較設(shè)計單組比較設(shè)計是指在同一個體上觀察實驗處理前后某種觀測指標的變化。此法的優(yōu)點是能排除個體間生物差異，但不適用于在同一個體上多次進行實驗和觀察的情況。還應(yīng)注意有時生理鹽水等陰性對照下前后兩次測量時一些指標也出現(xiàn)一定差異（如體重、血壓等）。2.配對比較設(shè)計配對比較設(shè)計是指實驗前將動物按性別、體重或其它有關(guān)因素加以配對，以基本相同的兩個動物為一對，配成若干對，然后將一對動物隨機分配到兩組中。兩組動物的數(shù)量、體重、性別等情況基本相同，取得均衡進行實驗，以減少誤差及動物間的個體差異。3.完全隨機化設(shè)計將動物隨機分配到處理組及對照組做實驗觀察。先將動物按順序編號，再用隨機化工具，如查隨機數(shù)字表，將動物分組。統(tǒng)計分析比較簡單，抗數(shù)據(jù)缺失能力較強。其缺點是對非實驗因素缺乏有效控制，只能依靠隨機化方法來平衡有關(guān)因素的影響。故精確度較低，誤差往往偏高。該方法適用于實驗對象同質(zhì)性較好的實驗設(shè)計。4.隨機區(qū)組設(shè)計在動物實驗時，可將一窩小鼠或大鼠劃為一個區(qū)組，確定數(shù)個區(qū)組后，按區(qū)組隨機化原則將各區(qū)組的動物隨機分配到處理組和對照組。注意每個區(qū)組的動物數(shù)量須與處理組要求的動物數(shù)量相等。若一窩仔數(shù)少于處理組數(shù)則不可采用，不能用別窩動物補充；反之，應(yīng)將多余的動物舍棄，不得放于其他區(qū)組。由于同窩動物在遺傳、營養(yǎng)、微生物攜帶上的一致性都較高，而各區(qū)組內(nèi)每只動物接受何種處理是隨機的，因而隨機區(qū)組設(shè)計的均衡性好，可減少誤差，提高實驗效率，統(tǒng)計分析也較簡易。其缺點是抗數(shù)據(jù)缺失能力較低。若一個區(qū)組的某個動物發(fā)生意外，那么整個區(qū)組都得放棄，或不得已采取缺項估計。5.拉丁方設(shè)計拉丁方設(shè)計是指由拉丁字母所組成的正方形排列，在同一橫行與同一縱列中都沒有重復的字母，可進行不同橫行或不同縱列之間對調(diào)，任意選擇下面一種正方形排列方式。該設(shè)計適用于多因素的均衡隨機，如比較某藥與陽性、陰性對照組的作用，要求用4種藥物編成A、B、C、D4個號碼，再按44拉丁方進行，每個動物（縱列）沒有重復使用的藥物，同一日期（橫行）也沒有重復使用的藥物，這樣既能控制動物間的個體差異，也可避免了注射日期先后帶來的實驗誤差,若樣本是5、6個,則可采用55或66拉丁方等.1234123412341ABCD1CDAB1CBAD2BCDA2BCDA2BADC3CDAB3ABCD3ADCB4DABC4DABC4DCBA1,3兩行對調(diào)2,4兩列對調(diào)6.正交設(shè)計正交設(shè)計是研究多因素試驗的一種設(shè)計方法。其特點是利用一套規(guī)格化的表格—正交表來安排試驗,適用于多因素、多水平、試驗誤差大、周期長等一類試驗的設(shè)計。在實驗設(shè)計過程中只要根據(jù)試驗條件直接套用正交表即可,而不需要另行編制。正交表在統(tǒng)計學書上都可查到,僅以L9(34)為例,說明其意義及使用方法.L代表正交表,右下角9字表示這張表需安排9次試驗，括號內(nèi)3表示這張表適用于三水平的試驗,3的右上方指數(shù)4表示最多可以安排4個因素的試驗，L9(34)的意思是,用這張表進行試驗設(shè)計,最多可以安排4個因素,每個因素取三個水平,一共進行9次試驗。常用的正交表中,適用于二水平試驗的有L4(23)、L8(27)；適用于三水平試驗的有L9(34)、L27(313)等,還有適用于四水平、五水平及水平數(shù)不等的各種正交表。選擇哪一種正交表要根據(jù)試驗的具體條件來決定。四、動物隨機分組方法動物隨機分組的方法很多,如抽簽、拈鬮等形式,但最好的方法是使用隨機數(shù)字表或計算器。隨機數(shù)字表上所有數(shù)字是按隨機抽樣原理編制的,表中任何一個數(shù)字出現(xiàn)在任何一個地方都是完全隨機的。計算器內(nèi)隨機數(shù)字鍵所顯示的隨機數(shù)也是根據(jù)同樣原理貯入的。隨機數(shù)字表使用簡單。假設(shè)從某群體中要抽10個個體作為樣本,那么,可以先閉目用鉛筆在隨機數(shù)字表上定一點。假定落在第10行8列的數(shù)字22上,那么可以向右(向左,向下,向上均可),依次找37、48、65、90、69、13、85、84、98,把包括22在內(nèi)的這10個號的個體按號作為樣本,來作為研究總體的依據(jù)。使用計算器產(chǎn)生隨機數(shù)時,每當按下2ndF(第二功能鍵)和RND（隨機數(shù)字鍵)時,隨機數(shù)就產(chǎn)生。產(chǎn)生的隨機數(shù)值是0.000至0.999。顯示的數(shù)前兩個小數(shù)位用作一個樣本個體,如輸入2ndFRND顯示為0.166,表明第十六個數(shù)據(jù)作為一個樣本個體,重復按鍵操作,直到產(chǎn)生所需的樣本大小。由于隨機數(shù)是隨機產(chǎn)生的,所以,絕對不會產(chǎn)生相同的數(shù)目。隨機數(shù)產(chǎn)生后,隨機分組要根據(jù)組數(shù)來進行,具體較為復雜。以下示例介紹使用隨機數(shù)字表進行隨機分組的方法.1.當分為二組時例:設(shè)有雄性Wistar大鼠12只,按體重大小依次編為1、2、3、……12號,試用完全隨機的方法,分為甲、乙兩組。分組方法:假設(shè)所產(chǎn)生的點是隨機數(shù)字表上第21行第6列的20,則從20開始,由上向下抄12個隨機數(shù)字,如下:動物編號:123456789101112隨機數(shù)字:202172295201617257164337組別:乙甲乙甲乙甲甲乙甲乙甲甲現(xiàn)在以隨機數(shù)字的奇數(shù)代表甲組,偶數(shù)代表乙組,則編號為2、4、6、7、9、11、12號分入甲組,而1、3、5、8、10號分入乙組。因兩組數(shù)字不等,繼續(xù)用隨機方法將甲組多余的一只調(diào)整給乙組,從上面最后一隨機數(shù)字37,接下去抄一個數(shù)為95以7除之(因甲組原分配7只)余數(shù)得4，即把原分配在甲組的第4個甲(即7號大鼠)調(diào)入乙組。如果甲組多兩個,則接下去抄兩個數(shù)，分別以8、7除之,余數(shù)即指要調(diào)入乙組的第幾個甲,余此類推。最后各組的鼠數(shù)就相等了,調(diào)整后各組鼠的編號為:組別鼠的編號甲組24691112乙組13578102.當分為三組時例:設(shè)有雄性的SD大鼠12只,按體重大小依次編號為1、2、3、……12號,試用完全隨機的方法,分為A、B、C三組。分組方法:假設(shè)所定的點是隨機數(shù)字表第30行10列的91,則從91開始,自左向右抄12個隨機數(shù)字，如下:動物編號:123456789101112隨機數(shù)字:918027632818629537883154除3余數(shù):120010221110組別:ABCCACBBAAAC調(diào)整組別:B以3去除各隨機數(shù)字,若余數(shù)為1,即該鼠歸A組；余數(shù)為2,歸入B組；余數(shù)為0,歸入C組。結(jié)果A組為5只,B組3只,C組4只。A組多一只應(yīng)調(diào)入B組,方法同上。仍采用隨機方法,從54后面接著抄,為39，除以5,余數(shù)為4,則將第4個A,即第10號鼠調(diào)入B組,調(diào)整后各組鼠的編號如下:組別:鼠的編號A組:15911B組:27810C組:34612對于將動物隨機分為四組或更多組，原理基本一致。3.當每個動物一組時例:設(shè)有A、B、C、D、E、F代表的6只家兔,試用完全隨機法將其每只分為一組。分組方法:從隨機數(shù)字表上用鉛筆任指一點,若為第11行第8列的32,則從32向左抄用6個數(shù)字,然后分別以6、5、4、3、2、1除之。凡除不盡的,即將余數(shù)寫下；除盡的,寫余數(shù)時即將其除數(shù)寫下。如下:隨機數(shù)325955485181除數(shù):654321余數(shù):243311隨機排列:BEDFAC上列第一個隨機數(shù)字余數(shù)為2,意即將六個字母中列在第二位的字母B寫在該數(shù)下,第二個數(shù)字的余數(shù)為4,即在剩下的五個字母列在第四位的E寫在該數(shù)字下面,余此類推。六個字母相應(yīng)號代表的兔隨機排列結(jié)果見上表最后一行。第三節(jié)影響動物實驗效果的動物個體因素與遺傳因素藥物毒性研究表明，如以人體反應(yīng)為衡量標準比較動物實驗結(jié)果與臨床試驗結(jié)果，可出現(xiàn)真陽性、真陰性、假陽性、假陰性四種情況。前兩者表示動物實驗結(jié)果與人體試驗結(jié)果基本一致，即動物毒性試驗有實用價值。但這種相似屬定性的，在定量上則肯定存在差異。后兩者顯示藥物反應(yīng)的種屬差異，即實驗動物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)在人體不出現(xiàn)（假陽性），或?qū)嶒瀯游镂闯霈F(xiàn)的毒性反應(yīng)卻在人體出現(xiàn)（假陰性）。其中假陰性的危害最大，要特別注意。如沙利度胺（反應(yīng)停）在大鼠不引起畸胎，對人則有較強的致畸胎作用，其動物毒性試驗為假陰性。實驗動物種屬、品系及個體差異對動物實驗結(jié)果的重復性和均一性有重要影響。一、種屬實驗動物種屬是影響動物實驗結(jié)果的重要因素。比較毒理學研究表明，不同種屬的實驗動物在代謝轉(zhuǎn)化、DNA損傷的誘導與修復等方面存在差異，這種差異與其進化程度相一致。由于不同種屬的實驗動物間解剖、生理、遺傳和代謝過程均有差別，故對藥物的毒性反應(yīng)可有量或質(zhì)的不同。1、易感性：不同種屬LA對同一實驗因素的易感性不同。如在研究醋酸棉酚對雄性動物生殖功能的影響時，發(fā)現(xiàn)小鼠很不敏感，大鼠和地鼠則很敏感。2．藥物代謝動力學在不同種屬動物身上做的實驗結(jié)果有較大差異，主要由于其藥物代謝動力學不同，藥效就不同。吸收過程差異：如大鼠吸收碘較家兔和豚鼠快，藥效也有差別。排泄過程差異：如大鼠體內(nèi)的巴比妥在3天內(nèi)可排出90%以上，而雞在7天內(nèi)僅排出33%，因而巴比妥對雞的毒性比對大鼠要大得多。3.藥物反應(yīng)性不同種屬動物對藥物的反應(yīng)也有差異。如嚙齒類實驗動物和家兔對催吐藥不產(chǎn)生嘔吐反應(yīng)，在犬、貓和人則易產(chǎn)生嘔吐。苯胺及其衍生物對犬、貓和豚鼠能引起與人相似的病理變化，產(chǎn)生變性血紅蛋白；對家兔則不易產(chǎn)生變性血紅蛋白，而小鼠則完全不產(chǎn)生。二、品種與品系不同品系、品種之間存在基因多態(tài)性，具有不同等位基因或不同基因型。其對動物實驗所給予的外來刺激所表達的反應(yīng)是不同的，使用不當也會影響動物實驗的結(jié)果。近交系實驗動物由于其基因型、表現(xiàn)型相同，故對刺激的反應(yīng)性一致，實驗結(jié)果的重復性、可比性極好；封閉群動物由于遺傳組成具有很高的雜合性，個體間反應(yīng)性具有差異，故個體間重復性和一致性沒有近交系動物好。不同品系實驗動物遺傳上的差異，造成其形態(tài)與功能的差異，并導致對同一刺激產(chǎn)生不同的反應(yīng)。有人觀察不同品系雄性小鼠暴露于相同濃度氯仿中,DBA/2品系死亡率為75%,DBA/1為51%,C3H為32%,BALB/c為10%.不同品系實驗動物對微生物感染的抵抗力也不同.如小鼠對細菌感染的抵抗力就存在品系差異.同種動物不同器官也存在反應(yīng)差異.。三、年齡與體重實驗動物的解剖生理特征和機體反應(yīng)性隨年齡而有明顯變化,往往幼年動物較成年敏感。敏感性從大到小順序為幼年＞老年＞成年。對毒物反應(yīng)的年齡差異可能與解毒酶活性有關(guān)。就人類而言，胎兒因缺乏這些解毒酶，故對毒物很敏感；新生兒出生后8周解毒酶才達到成人水平。實驗動物也一樣，大鼠葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換酶約在出生后30天才達到成年大鼠水平。兔出生4周后，肝臟解毒酶活性才與成年兔接近。實驗動物一生對藥物的毒性反應(yīng)水平，是隨年齡變化的動態(tài)過程。如八甲磷在體內(nèi)須經(jīng)羥化才具有毒性，以35mg/kg劑量給初生大鼠灌胃不引起死亡，但相同劑量給成年大鼠灌胃則全部死亡。老年實驗動物對毒物的耐受性提高，可能是排泄及生物轉(zhuǎn)化能力降低的緣故。實驗動物體重與年齡一般呈正比關(guān)系，因而同批實驗的動物年齡應(yīng)盡可能一致，體重應(yīng)大致相近，一般相差不超過10%。四、性別一般而言，雌性實驗動物對藥物的敏感性高于雄性，但隨受試物不同而異。一般認為，動物對激素的依存性，是其藥物毒性反應(yīng)性別差異的主要原因。。研究表明雄性激素能促進細胞色素P450的活力，藥物在雄性實驗動物體內(nèi)易于代謝，因此雌性大鼠對藥物較雄性敏感。因此，在藥品安全性評價研究中，通常選擇實驗動物應(yīng)雌雄各半。若發(fā)現(xiàn)有明顯的性別差異時則應(yīng)分別測定不同性別實驗動物的LD50值。五、生理及功能狀態(tài)實驗動物在處于特殊的生理狀態(tài)如懷孕、哺乳時，其體重及某些生理生化指標將有所不同。因此，一般實驗研究不宜采用懷孕、哺乳的實驗動物。但為了闡明藥物對妊娠及產(chǎn)前胎兒的影響時，就必須選用這類實驗動物。妊娠和哺乳期大鼠和小鼠最適合進行這類實驗。實驗動物由于所處的功能狀態(tài)不同，對藥物的反應(yīng)也常常受到影響。如動物在體溫升高的情況下對解熱藥比較敏感，而體溫不高時則不敏感；血壓高時對降壓藥比較敏感，而在血壓低時對降壓藥敏感性就差，反而可能對升壓藥比較敏感。六、健康狀況一般來說，有病動物對藥物的耐受性比健康動物要小，故有病動物比較容易中毒死亡?；疾』驙I養(yǎng)不良的家兔不易復制成動脈粥樣硬化模型，維生素C缺乏的豚鼠對麻醉藥很敏感。動物潛在性感染對實驗結(jié)果的影響也很大，如觀察肝功能在實驗前后變化時，必須要排除實驗用的家兔是否患有球蟲病，不然家兔的肝臟上已有很多球蟲囊，肝功能必然發(fā)生變化，所測結(jié)果波動很大。因此，動物實驗一定要選用健康動物，最好選擇SPF級實驗動物，不宜采用不健康或患病的實驗動物，否則就會影響實驗結(jié)果。為確保實驗動物健康，要做好實驗前檢疫。實驗前通常要觀察7-14天，發(fā)現(xiàn)不健康動物應(yīng)予以剔除。第四節(jié)影響動物實驗效果的生物因素生物因素涉及同種動物因素和異種生物因素等。同種動物因素包括社會地位、勢力范圍和飼養(yǎng)密度等，異種生物因素主要是指微生物與寄生蟲及人等因素。一、同種動物因素實驗動物存在為社會地位和勢力范圍的相互爭斗。動物的爭斗和社會地位可影響內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。實驗動物要有一定的活動面積和空間。密度大使動物活動受到限制，同時由于排泄物大量增加，使溫度、濕度、有害氣體的濃度增加，動物患傳染病的機會增大，內(nèi)分泌和代謝也隨之發(fā)生改變，從而影響實驗結(jié)果。因此實驗動物飼養(yǎng)要有合理的密度。二、異種生物因素異種動物之間可產(chǎn)生相互影響。如將小鼠和貓同室飼養(yǎng)，小鼠就會出現(xiàn)性周期不規(guī)則的現(xiàn)象；因此，不同種、品系的動物要分室飼養(yǎng)。實驗動物是由人飼養(yǎng)管理和進行實驗的，飼養(yǎng)管理和科研人員的素質(zhì)直接影響動物實驗結(jié)果。當動物遭受到虐待、創(chuàng)傷、粗暴對待等意外刺激時，其內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、機體代謝都與正常時不同。應(yīng)養(yǎng)成日常善待動物，并熟練掌握捉拿、固定、注射、給藥、手術(shù)等技能，減少對動物的不良刺激。同時要合理設(shè)計實驗，按照實驗室操作規(guī)范（GLP）和標準操作程序（SOP）嚴格執(zhí)行，才能得到好的實驗結(jié)果。1．病毒感染對動物實驗的影響（1）鼠痘病毒：鼠痘病毒是危害實驗小鼠最為嚴重的病毒之一。感染鼠痘病毒的急性病例是小鼠突然死亡，使實驗中斷；而慢性病例則出現(xiàn)全身癥狀，使實驗結(jié)果混亂；隱性感染病例則無臨床癥狀，許多因素如實驗性結(jié)核、X射線、各種化學毒素、組織移植、腫瘤和運輸?shù)榷寄芗せ钍蠖徊《径故蠖涣餍?，從而干擾實驗結(jié)果。（2）仙臺病毒：仙臺病毒是大、小鼠群中常見潛在性感染的病毒之一，其感染可嚴重影響體液和細胞介導的免疫應(yīng)答，抑制大鼠淋巴細胞對綿羊紅細胞的抗體應(yīng)答，減弱淋巴細胞對植物血凝素和刀豆素的促有絲分裂應(yīng)答。對小鼠免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生長期的影響，包括自發(fā)性免疫疾病，發(fā)病率明顯增加；抑制吞噬細胞的吞噬能力及在細胞內(nèi)殺滅降解被吞噬細菌的能力，對移植免疫學產(chǎn)生影響，可加速同種異系甚至同系小鼠之間皮膚移植的排斥；導致動物的移植瘤的抗原性質(zhì)改變、致癌性降低而難以繼續(xù)傳代。（3）小鼠肝炎病毒：該病毒的潛在性感染可改變機體的各種免疫應(yīng)答參數(shù)，顯著降低小鼠血清免疫球蛋白水平，影響巨噬細胞的數(shù)目、吞噬活性和殺傷腫瘤細胞活性，增強自然殺傷T細胞活性，誘生干擾素；使許多酶系統(tǒng)發(fā)生改變，增高某些肝酶活性，降低另一些肝酶活性；裸鼠感染可嚴重影響腫瘤免疫學的研究。（4）淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦炎病毒：該病毒能在B、T淋巴細胞和巨噬細胞中大量復制，從而抑制體液和細胞介導的免疫應(yīng)答。?？晌廴疽浦材[瘤，影響腫瘤學研究。2．細菌感染對動物實驗的影響多數(shù)都表現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、被毛粗亂、體重下降、行為呆滯等全身癥狀。（1）人獸共患病原和動物致病菌：這類細菌中，有的如沙門氏菌、志賀氏菌、布氏桿菌、結(jié)核分枝桿菌等，不僅可引起實驗動物的疾病，而且也是人類的重要致病菌，應(yīng)堅決予以排除，以確保人員的健康和安全。（2）條件性致病菌：一般不引起動物自然發(fā)病。當動物在某些誘因的作用下，機體抵抗力下降，導致疾病發(fā)生，甚至流行。它們一方面不斷地向外部環(huán)境排菌，成為危險的傳染源；另一方面，在動物實驗過程中，由于受試驗因素的刺激而發(fā)病，可使實驗期間的動物發(fā)生不規(guī)律死亡，導致實驗失敗。如隱性感染綠膿桿菌的動物在進行放射性照射試驗時，常發(fā)生致死性敗血癥。（3）正常菌群的細菌：許多正常菌群成員在受到內(nèi)外環(huán)境的變化而發(fā)生菌群失調(diào)時，可發(fā)生數(shù)量的變化和位置的改變，由非致病菌轉(zhuǎn)變成為致病菌。3．真菌感染對動物實驗的影響：病原真菌大多為人獸共患病原，其病原性比其它微生物弱，一般為慢性過程，多呈散發(fā)性，病理變化缺乏特征性，多以慢性增生性炎癥為主。若機體免疫功能低下，特別是細胞免疫功能低下時，常發(fā)生真菌感染。不僅影響科學實驗的準確性，而且容易污染環(huán)境，威脅動物群體和飼養(yǎng)、實驗人員的健康。一旦發(fā)現(xiàn)實驗動物被真菌感染，應(yīng)立即將飼養(yǎng)單元所有動物一并處死、焚燒，防止隱性感染動物的污染。4.寄生蟲感染對動物實驗的影響：實驗動物感染寄生蟲后不僅蟲體對動物機體造成一定的損害，而且動物機體也對蟲體產(chǎn)生反應(yīng)，使動物機體的生理、生化及免疫學指標發(fā)生改變，從而影響實驗結(jié)果。具體表現(xiàn)為搶奪宿主的營養(yǎng)、體外寄生蟲騷擾動物、對宿主機械性損傷、對宿主產(chǎn)生毒性作用、對宿主生理生化和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響等?；紫x在動物小腸內(nèi)寄生，以半消化物質(zhì)為食，搶奪宿主大量營養(yǎng)并使動物出現(xiàn)體重下降、精神不振、消瘦、發(fā)育緩慢等一系列營養(yǎng)不良癥狀，在腸道中蟲體有時可與腸內(nèi)粘液混合形成栓塞堵塞腸道，引起腸梗阻，嚴重時造成腸破裂。第五節(jié)影響動物實驗結(jié)果的飼養(yǎng)環(huán)境因素見第四章實驗動物的環(huán)境控制溫度濕度氣流與風速光照噪聲空氣潔凈狀況第六節(jié)影響動物實驗效果的動物營養(yǎng)因素一、影響因素1、營養(yǎng)素的質(zhì)與量提供動物的養(yǎng)分過多、缺乏或失衡將影響實驗動物的健康，并影響實驗結(jié)果。如小鼠維生素A過量可致其繁殖紊亂和胚胎畸形；豚鼠維生素C缺乏，可致壞血病、生殖機能下降等癥狀，甚至造成死亡。動物的某些系統(tǒng)和器官，特別是消化系統(tǒng)的機能和形態(tài)隨飼料品種的更換而變異，如豚鼠日量中粗纖維含量不足，可引起其出現(xiàn)排糞障礙和脫毛現(xiàn)象。攝入過多熱量可加速或加重衰老、退行性變、傳染病與腫瘤演變過程，以及對化學物質(zhì)的毒性反應(yīng)，從而嚴重干擾有關(guān)研究。2、飼料污染實驗動物日糧中含有許多天然、合成的化合物，這些化合物可能對生化和生理過程產(chǎn)生影響，但并不引起明顯的中毒癥狀。飼料的污染物包括氯化烴類、有機磷類、多氯聯(lián)苯類和重金屬以及黃曲霉素、硝酸鹽、亞硝胺和雌激素化合物等。3、飲水缺水或長期飲水不足，可對動物健康和生殖機能造成嚴重危害。缺水初期食欲明顯減退，尤其不愿進食干飼料；隨著失水的增多，干渴的感覺日益嚴重，可導致食欲完全喪失，消化機能減弱至喪失，機體免疫力和抗病力顯著降低。二、影響機制（一）進行非營養(yǎng)研究時的影響在進行非營養(yǎng)研究時，由于動物的營養(yǎng)狀況是與其生化指標、免疫反應(yīng)息息相關(guān)的，故會影響動物實驗結(jié)果。1、對采食量的影響飼料的原料組成不同時，能量濃度也有差異，這直接影響動物的采食量，而動物的采食量變化就會影響動物所攝入藥量的多少，從而影響實驗結(jié)果。2、對生長發(fā)育的影響實驗動物的生長情況與飼料中所含營養(yǎng)素是否全面、充足、平衡，有毒有害成分的多少，適口性如何，甚至與飼料的軟硬程度等都有密切關(guān)系。營養(yǎng)因素特別是日糧的蛋白質(zhì)水平，不僅影響實驗動物的斷奶體重、體長和尾長的生長曲線，而且影響各種臟器的重量和臟器系數(shù)，因而亦將影響實驗結(jié)果的準確性和重復性。3、對生理生化指標的影響當飼料中的某種營養(yǎng)素含量發(fā)生改變時，必然導致血液及某些器官組織中該種營養(yǎng)素含量改變，從而影響相關(guān)生理生化指標。4、對免疫功能的影響動物的營養(yǎng)狀況影響動物的健康狀況，并影響其免疫系統(tǒng)和機能。例如飼料中維生素A不足時，動物的免疫機能明顯下降，此時動物的生長發(fā)育，甚至生化指標可能還未改變。5、對動物疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的影響某些營養(yǎng)因素與癌、心血管疾病等非傳染性疾病關(guān)系密切。如在家兔骨折實驗中，使用全價營養(yǎng)顆粒料，家兔骨骼如期愈合，而飼喂大麥青菜的家兔骨骼愈合速度則較慢。6、對動物麻醉反應(yīng)的影響采食全價營養(yǎng)顆粒料的家兔在麻藥注射后約10分鐘，絕大部分反射雖遭到不同程度的抑制，但眼球活動、瞳孔的大小與麻醉前無顯著變化，且手術(shù)后復蘇快。而采食營養(yǎng)失衡飼料的家兔，在麻藥注射后10分鐘左右，絕大多數(shù)都處于深度抑制狀態(tài)。7、其它飼料中的抗營養(yǎng)因子、毒素或農(nóng)藥殘留、重金素污染等均可對研究結(jié)果造成直接或間接影響。（二）進行營養(yǎng)研究時的影響在進行營養(yǎng)學研究時，飼料中的營養(yǎng)因素與動物的營養(yǎng)狀況對研究結(jié)果的影響更大、更直接。1、動物早期營養(yǎng)狀況動物早期的營養(yǎng)對其后期的營養(yǎng)狀況有影響。動物妊娠和哺乳階段的營養(yǎng)水平不僅影響仔代斷奶前的生長發(fā)育，而且對其斷奶后的生長發(fā)育特別是營養(yǎng)狀況有影響，當這種影響較嚴重時，即使以后給予充足的營養(yǎng)也無濟于事，造成不可逆的后果。2、動物實驗時的營養(yǎng)在動物體內(nèi)，各種營養(yǎng)素之間存在非常復雜的關(guān)系，了解其關(guān)系對于營養(yǎng)研究至關(guān)重要。如維生素D和鈣、磷之間密切相關(guān)，鈣、磷之間也有密切關(guān)系。當我們研究維生素D的需要量時，要注意鈣、磷水平與鈣、磷比例。3、動物日糧在與營養(yǎng)相關(guān)研究中，尤其是營養(yǎng)與免疫、營養(yǎng)與癌癥、營養(yǎng)與衰老的研究已成為熱點，動物日量的控制問題日益受到重視。如研究維生素E與免疫功能的關(guān)系時，要注意控制日量中維生素A、微量元素硒、錳等的水平。此外，動物日量的種類對實驗結(jié)果也有一定影響。第七節(jié)影響動物實驗效果的藥物因素一、抗菌素某些抗菌素對實驗動物有毒性，普魯卡因?qū)﹄嗍?、兔和小鼠有毒性，用含有鹽酸普魯卡因的青霉素－雙氫鏈霉素給蒙古沙鼠注射后2h，可引起急性中毒和死亡。許多抗菌素對免疫系統(tǒng)有關(guān)細胞的功能具有不良影響。如四環(huán)素類可抑制小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)和巨噬細胞的體內(nèi)趨化性?？咕剡€可對實驗結(jié)果造成影響。如經(jīng)常使用抗菌素可引起動物心血管功能變化，有些抗菌素不僅減弱心肌和動脈平滑肌的收縮力，而且改變其他藥物如去甲腎上腺素增強收縮力的作用?？咕剡€影響代謝，并由此影響其他物質(zhì)的毒性，或改變藥物動力學。如氯霉素抑制肝臟微粒體酶，從而影響通過肝臟微粒體酶系統(tǒng)代謝的藥物，如巴比妥類麻醉劑的藥效。二、麻醉劑和鎮(zhèn)靜劑麻醉劑對動物本身可有毒性，或可能增強其他藥物的毒性。麻醉劑對心血管功能的影響已有許多研究。如戊巴比妥和氟烷可通過依賴鈣的生化過程，而直接影響心肌和血管平滑肌，并影響平滑肌對被試藥物的敏感性及實驗結(jié)果。麻醉劑還會影響免疫功能。如氟烷在血中達到一定濃度時，會減弱大鼠淋巴細胞對致有絲分裂原的應(yīng)答；氟烷還有降低趨化性、減弱吞噬作用、改變淋巴細胞代謝活性作用。某些麻醉劑還可能影響腫瘤轉(zhuǎn)移手術(shù)后的轉(zhuǎn)歸。一、分組實驗分組應(yīng)當隨機而不是隨意。記錄及報告中，應(yīng)說明采用什么隨機分組方法。要設(shè)立空白對照組，以排除非實驗因素帶來的影響。還要注意溶媒或其他賦形劑等的影響，亦須設(shè)立相應(yīng)的對照組進行比較。二.實驗藥物動物實驗中常常需要給動物體內(nèi)注入各種藥物以觀察其作用和變化。因此給藥的途徑、制劑是影響實驗中很重要的問題。藥物的濃度和劑量也是一個重要問題，劑量設(shè)計是否合理是實驗成功與否的關(guān)鍵。動物和人用藥劑量的換算以體表面積計算比以體重換算好一些。三、給藥時間動物試驗的給藥時間應(yīng)當一致。一是可比性強，二是避免錯誤，而影響其他藥理試驗甚至臨床用藥。四、試驗周期急性毒性試驗給藥后至少觀察1周，有的要觀察2周或更長時間。五、動物實驗環(huán)境應(yīng)符合國家及地方的標準，并保持穩(wěn)定。環(huán)境溫度對藥物的LD50影響較大。六、資料記錄毒性試驗過程要做好觀察記錄，特別要詳細記錄中毒癥狀，尤其中毒發(fā)生時間、持續(xù)時間和恢復時間，或死亡時間等。七、剖檢對急性毒性（7或14d后）存活的實驗動物要稱量體重，尤其是低劑量組動物，以了解中毒效應(yīng)是短暫還是較長期的效應(yīng)。對死亡動物應(yīng)及時剖檢，觀察組織器官有無充血、出血、水腫或其他改變。肉眼觀察有明顯改變者，應(yīng)作病理鏡檢。八、評價同種實驗動物測定LD50時，不同給藥途徑的LD50值大小次序為，口服＞肌肉注射、皮下注射＞腹腔注射＞靜脈注射，但也有少數(shù)藥物例外。因此對具體藥物要具體分析。九、關(guān)于最大限度試驗我國新藥審批辦法關(guān)于急性毒性試驗未提最大限度試驗，而有最大耐受劑量（MTD），這比較符合實際。并且規(guī)定，如果口服大于5g/kg，或注射大于2g/kg均不產(chǎn)生急性毒性癥狀或死亡，就不必做進一步試驗。當然這不適用于中藥及某些西藥復方制劑，更不能依此作為長期毒性限度試驗的依據(jù)。第九節(jié)影響動物實驗效果的動物實驗技術(shù)環(huán)節(jié)因素一、動物選擇應(yīng)按照不同實驗的要求選擇合適的動物。如作腫瘤的研究工作，就必須了解哪種動物是高癌種，哪種是低癌種，各種動物自發(fā)性腫瘤的發(fā)生率是多少。二、實驗季節(jié)生物體的許多功能隨著季節(jié)產(chǎn)生規(guī)