鹽脅迫下ca2+對(duì)蠶豆氣孔運(yùn)動(dòng)及質(zhì)膜k

鹽脅迫下ca2+對(duì)蠶豆氣孔運(yùn)動(dòng)及質(zhì)膜k

土壤鹽分限制了作物的種植面積和產(chǎn)量，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。近20%的農(nóng)業(yè)面積和50%的耕地處于鹽勢(shì)嚴(yán)重的兩難境地。鹽脅迫最大的危害是可利用水的虧缺,氣孔作為植物體水分散失的門戶,其開與關(guān)對(duì)植物抵抗鹽脅迫起著重要作用。早期研究發(fā)現(xiàn),外源NaCl處理可誘導(dǎo)植物氣孔運(yùn)動(dòng)。其中,Na+可以通過高親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)體(highaffinityK+transporter,HKT)和低親和陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(lowaffinitycationtransporter,LCT)以及非選擇性陽離子通道(NSC)進(jìn)入細(xì)胞。但迄今為止,有關(guān)Na+對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制還不甚清楚。Ca2+已被廣泛認(rèn)為是胞內(nèi)信使,參與ABA、H2O2誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。諸多生物及非生物脅迫都會(huì)引起植物胞質(zhì)Ca2+濃度([Ca2+]cyt)的上升,植物可以根據(jù)[Ca2+]cyt變化的差異如位置、幅度、頻率及持續(xù)的時(shí)間解碼不同的刺激,從而使細(xì)胞做出不同的反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)胞外Ca2+可引起保衛(wèi)細(xì)胞[Ca2+]cyt振蕩誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉。胞外Ca2+濃度([Ca2+]ext)增加可引起[Ca2+]cyt上升,增強(qiáng)鹽忍耐。最近,研究酵母發(fā)現(xiàn)胞外Ca2+通過Cch1pandMid1p-Ca2+運(yùn)輸體系進(jìn)入細(xì)胞提高[Ca2+]cyt,而擬南芥中胞外Ca2+可能作為一種信號(hào)通過與質(zhì)膜Ca2+受體CAS結(jié)合,激活磷脂酶C(PLC),增加IP3濃度,誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+以提高[Ca2+]cyt。然而胞外Ca2+如何進(jìn)入植物保衛(wèi)細(xì)胞還不甚了解。另外,已有研究表明[Ca2+]cyt的上升,可通過降低Na+的吸收,有效地控制Na+/K+在植物中選擇性積累,增加其對(duì)NaCl脅迫的抗性。盡管如此,胞外Ca2+緩解鹽脅迫機(jī)理以及對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)離子通道如何調(diào)節(jié)并不十分清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn),H2O2可通過對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜K+通道及胞內(nèi)pH的調(diào)節(jié)介導(dǎo)ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉,也可通過誘導(dǎo)質(zhì)膜H+-ATPase脫磷酸化介導(dǎo)ABA抑制藍(lán)光誘導(dǎo)的氣孔開放。Yan等報(bào)道H2O2也可介導(dǎo)ABA抑制的氣孔開放,Pei等報(bào)道H2O2可以激活保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜Ca2+通道,促使Ca2+內(nèi)流。那么,胞外Ca2+緩解鹽脅迫,抑制氣孔開放是否有H2O2的參與則不清楚本研究針對(duì)上述問題,利用藥理學(xué)、電生理學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的研究技術(shù)和方法,探討外源Ca2+在NaCl脅迫條件下對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜K+離子通道的調(diào)控機(jī)制,以期明確外源Ca2+對(duì)NaCl脅迫的緩解機(jī)理,為改善鹽漬土上的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1培養(yǎng)土營養(yǎng)土質(zhì)將蠶豆(ViciafabaL.)種子用75%乙醇表面消毒5min,在生化培養(yǎng)箱中催芽3～4d,播種于培養(yǎng)土(營養(yǎng)土∶蛭石為2∶1)中。蠶豆生長的光/暗周期為12h/12h,光照強(qiáng)度為0.20～0.30mmolm-2s-1,晝夜溫度分別為25℃±2℃和20℃±2℃,相對(duì)濕度在70%左右,生長期間無脅迫。1.2lyasey-33、二氯熒光素二乙酸酯及2dcf-da纖維素酶(CellulaseRS)購自日本YakultHonsha公司;果膠酶(PectolyaseY-23)購自日本SeishinPharmaceutical公司;二氯熒光素二乙酸酯(dichlorofluorescindiacetate,H2DCF-DA)購自Sigma公司,使用前配成50mmolL-1DMSO溶液,分成小包裝冷凍保存;其他試劑均為分析純。1.3氣孔關(guān)閉試驗(yàn)參見Zhang等方法,取3～4周齡蠶豆苗頂端第1～2對(duì)完全展開的葉片,用蒸餾水洗凈,撕取下表皮,洗去葉肉細(xì)胞后,切成5mm長的表皮條,暗處理2h誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉。用CO2-free10mmolL-1MES50mmolL-1KCl(pH6.15)開放緩沖液為對(duì)照,以緩沖液中加入NaCl和不同濃度的CaCl2為處理,同時(shí)在23℃下,光照(0.20～0.30mmolm-2s-1)2h。然后在10×25倍倒置顯微鏡下用測(cè)微尺測(cè)定氣孔寬長比值。每個(gè)處理至少用3個(gè)表皮條,每個(gè)表皮條隨機(jī)測(cè)20個(gè)氣孔開度,每個(gè)處理重復(fù)5次(不少于300個(gè)氣孔開度),統(tǒng)計(jì)平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。1.4流、分離、流、壓的檢測(cè)分離原生質(zhì)體參照Zhang等的方法,取3～4周齡苗頂端第2對(duì)完全展開葉,用蒸餾水洗凈,撕取下表皮,洗凈葉肉細(xì)胞后,切成約5mm長的表皮條,進(jìn)行酶解提取。酶解液含1.3%纖維素酶RS、0.0075%果膠酶(PectolyaseY-23)、0.25%牛血清蛋白(BSA)、0.5mmolL-1抗壞血酸,用山梨醇調(diào)滲透壓至460mOsmolkg-1,pH5.5(KOH)。記錄質(zhì)膜K+電流采用Hamill等常規(guī)全細(xì)胞記錄技術(shù)。非NaCl脅迫下所用細(xì)胞外液含10mmolL-1谷氨酸鉀、2mmolL-1MgCl2、1mmolL-1KOH、10mmolL-1Mes;NaCl脅迫處理細(xì)胞外液含100mmolL-1NaCl、谷氨酸鉀10mmolL-1、2mmolL-1MgCl2、1mmolL-1KOH、10mmolL-1Mes,用山梨醇調(diào)滲透壓至460mOsmolkg-1,并調(diào)至pH5.5(KOH)。NaCl脅迫及非脅迫下電極液均包含100mmolL-1谷氨酸鉀、2mmolL-1MgCl2、4mmolL-1KOH、1.1mmolL-1MgATP、0.1mmolL-1CaCl2、10mmolL-1Hepes,山梨醇調(diào)滲透壓為510mOsmolkg-1,pH7.2(KOH)。刺激電壓從–190mV逐級(jí)去極化到+110mV,每級(jí)為+20mV,維持時(shí)間3s,頻率為0.2Hz。全細(xì)胞封接形成10～15min后采集數(shù)據(jù),以連續(xù)兩次穩(wěn)定的值作為對(duì)照電流,不同濃度Ca2+處理10min后采集處理數(shù)據(jù)。使用EPC-9膜片鉗放大器(HEKAElektronik,Lambrecht,Germany)測(cè)定全細(xì)胞電流,使用PULSE+PULSEFIT軟件采集和分析全細(xì)胞電流,每一試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)6～8次。1.5細(xì)胞熒光分析參見Lü等的方法,事先取出表皮條,在5mL負(fù)載緩沖液(10mmolL-1Tris,50mmolL-1KCl,pH7.2)中培養(yǎng),然后將H2O2熒光探針加入盛有表皮條的負(fù)載緩沖液中混均,使H2DCF-DA終濃度為50μmolL-1,負(fù)載溫度控制在25℃,負(fù)載時(shí)間15min。然后將負(fù)載H2DCFDA的表皮條用新鮮負(fù)載緩沖液漂洗兩次,以洗去細(xì)胞表層多余的探針,然后用蓋玻片迅速將表皮條固定在顯微鏡載物臺(tái)上,用激光共聚焦掃描顯微鏡(FV1000,Olympus)觀察。LCSM的工作條件為:Ex=488nm,Em=500～550nm,Power2%,Zoom3～5,中速掃描,Frame512×512pixel;對(duì)每個(gè)細(xì)胞熒光變化做適時(shí)記錄。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)5次,當(dāng)結(jié)果一致時(shí),取其中一個(gè)細(xì)胞用FV10ASW1.6該軟件用于分析熒光強(qiáng)度2結(jié)果與分析2.1胞外ca2+對(duì)nacl誘導(dǎo)氣孔開度的影響圖1所示,100mmolL-1NaCl處理可明顯促進(jìn)氣孔開放,其增加值為35.6%,等濃度KCl代替NaCl處理具有類似的效應(yīng)。低濃度的胞外Ca2+(0.1mmolL-1CaCl2)可促進(jìn)NaCl誘導(dǎo)的氣孔開放,較高濃度的胞外Ca2+處理可有效抑制NaCl誘導(dǎo)的氣孔開放,其中10mmolL-1CaCl2處理可使NaCl誘導(dǎo)的氣孔開度下降39.0%,顯著抑制NaCl誘導(dǎo)的氣孔開放。另外,非NaCl脅迫下10mmolL-1CaCl2胞外處理幾乎完全抑制氣孔開放。2.2鹽脅迫對(duì)質(zhì)膜k+通道的影響非鹽脅迫下,低的[Ca2+]ext(0.1mmolL-1CaCl2)處理對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)向K+及外向K+通道基本沒有影響,而較高的[Ca2+]ext(10mmolL-1CaCl2)處理幾乎完全抑制保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)向K+通道電流顯著激活其外向K+通道電流,1mmolL-1LaCl3的加入并不能緩解上述效應(yīng)(圖2)。在100mmolL-1NaCl脅迫條件下,0.1mmolL-1CaCl2顯著激活保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜外向K+通道,對(duì)內(nèi)向K+通道影響甚微,然而10mmolL-1CaCl2處理能顯著抑制保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜外向及內(nèi)向K+通道,1mmolL-1LaCl3的加入能很好地緩解鹽脅迫下高的[Ca2+]ext處理對(duì)質(zhì)膜內(nèi)向及外向K+通道電流的抑制作用。表明在鹽脅迫下胞外Ca2+可能主要通過質(zhì)膜Ca2+通道進(jìn)入胞內(nèi),進(jìn)而調(diào)控質(zhì)膜K+通道(圖3)。為了進(jìn)一步比較胞外Ca2+對(duì)質(zhì)膜K+通道的調(diào)控機(jī)制,選擇同一電壓下質(zhì)膜K+通道電流的變化進(jìn)行比較。100mmolL-1NaCl能抑制保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)向K+通道,抑制K+電流55.3%(圖4-A),但對(duì)質(zhì)膜外向K+通道活性影響不大(圖4-B)。較低的[Ca2+]ext(0.1mmolL-1CaCl2)對(duì)脅迫與非脅迫下的保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)向K+通道有輕微的促進(jìn)作用(圖4-A),卻能顯著增加鹽脅迫下質(zhì)膜外向K+通道電流,其增加值為140%(圖4-B)。較高的[Ca2+]ext(10mmolL-1CaCl2)能明顯抑制脅迫及非脅迫下質(zhì)膜內(nèi)向K+通道電流(圖4-A),且增加非脅迫下質(zhì)膜外向K+通道電流,其增加值為148%(圖4-B)。與上面分析結(jié)果類似,1mmolL-1LaCl3能緩解較高的[Ca2+]ext對(duì)鹽脅迫下質(zhì)膜K+通道的抑制(圖4-A)。2.3s1nacl脅迫對(duì)財(cái)務(wù)細(xì)胞h2的誘導(dǎo)用H2O2專一的熒光探針二氯熒光素二乙酸酯(H2DCF-DA)標(biāo)記蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞來檢測(cè)胞內(nèi)H2O2的水平變化。結(jié)果顯示,100mmolL-1NaCl脅迫下,10mmolL-1Ca2+處理表皮條2min后即可誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞中H2O2產(chǎn)生,處理10min后能顯著誘導(dǎo)H2O2在保衛(wèi)細(xì)胞中積累。單獨(dú)使用100mmolL-1NaCl或10mmolL-1Ca2+以及100mmolL-1NaCl+0.1mmolL-1Ca2+等處理均不能明顯誘導(dǎo)H2O2積累(圖5)。3胞外ca2+對(duì)質(zhì)膜k+通道的影響在鹽脅迫條件下,植物調(diào)整合適的氣孔開度以防止水分的過度散失,并確保二氧化碳的吸收以保證光合作用的進(jìn)行,這對(duì)植物的生長發(fā)育是至關(guān)重要的。本試驗(yàn)對(duì)蠶豆表皮生物學(xué)分析顯示,100mmolL-1NaCl處理可明顯促進(jìn)氣孔開放(圖1),而等濃度KCl代替NaCl處理具有類似的效應(yīng)。說明高的胞外K+和Na+脅迫均可以加強(qiáng)K+和Na+向胞內(nèi)的運(yùn)輸,以誘導(dǎo)氣孔開放。Schachtman等報(bào)道Na+可以通過內(nèi)向K+通道與K+競爭進(jìn)入細(xì)胞,也可以通過外向K+通道進(jìn)入細(xì)胞,從而改變保衛(wèi)細(xì)胞的滲透勢(shì),迫使氣孔開放。由圖4可知,100mmolL-1NaCl處理可以部分降低K+的內(nèi)向通道電流,并不影響其外向K+通道電流,說明Na+可能與K+競爭通過內(nèi)向K+通道進(jìn)入細(xì)胞,但Véry等報(bào)道Na+并不通過內(nèi)向K+通道與K+競爭進(jìn)入細(xì)胞,而是通過外向K+通道進(jìn)入細(xì)胞。無論K+和Na+以怎樣的機(jī)制進(jìn)入保衛(wèi)細(xì)胞,NaCl脅迫條件下氣孔開放對(duì)植物來說都極其不利。Ca2+作為胞內(nèi)重要第二信使,調(diào)控植物諸多生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答過程。非鹽脅迫下,較高濃度的胞外Ca2+可以誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉(圖1),這與McAinsh等的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn),高的[Ca2+]ext幾乎完全抑制質(zhì)膜內(nèi)向K+通道,并激活外向K+通道(圖2),這與Schroeder等報(bào)道[Ca2+]cyt升高可以抑制內(nèi)向K+通道、激活外向K+通道結(jié)果相似。因此推測(cè),胞外Ca2+可能是通過引起[Ca2+]cyt升高以發(fā)揮其對(duì)質(zhì)膜K+通道的調(diào)節(jié)功能。Tang等和Epstein等報(bào)道擬南芥中胞外Ca2+可作為一種信號(hào),與其質(zhì)膜受體CAS結(jié)合,通過IP3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+以提高[Ca2+]cyt。胞外Ca2+有沒有可能通過質(zhì)膜Ca2+通道直接進(jìn)入胞內(nèi)提高[Ca2+]cyt?為證實(shí)這一點(diǎn),在胞外液中加入1mmolL-1LaCl3,如圖2所示,LaCl3的加入并不能緩解高的[Ca2+]ext對(duì)質(zhì)膜K+通道的調(diào)控作用,因此基本上排除了非鹽脅迫下胞外Ca2+通過質(zhì)膜Ca2+通道直接進(jìn)入胞內(nèi)的可能。在NaCl脅迫條件下,高濃度CaCl2處理也可顯著抑制NaCl脅迫誘導(dǎo)的氣孔開放(圖1),而且較高的胞外Ca2+能同時(shí)抑制質(zhì)膜內(nèi)向及外向K+通道,該現(xiàn)象可以被1mmolL-1LaCl3緩解(圖3),表明在鹽脅迫條件下,[Ca2+]ext可能主要通過質(zhì)膜Ca2+通道進(jìn)入細(xì)胞,以提高[Ca2+]cyt,從而阻止K+內(nèi)流,防止Na+通過質(zhì)膜K+通道進(jìn)入細(xì)胞(圖3,圖4),又可促進(jìn)Na+跨質(zhì)膜外流,進(jìn)而抑制NaCl脅迫誘導(dǎo)的氣孔開放(圖1),這將極大地提高NaCl脅迫下植物的保水能力。值得注意的是,10mmolL-1CaCl2胞外處理,對(duì)鹽脅迫和非鹽脅迫下質(zhì)膜K+通道有著并不完全相同的調(diào)控結(jié)果(圖4)。產(chǎn)生該現(xiàn)象的可能原因是在這兩種情況下胞外Ca2+進(jìn)入胞內(nèi)的方式存在差異,造成[Ca2+]cyt振蕩存在諸如位置、幅度、頻率及持續(xù)時(shí)間等的不同,導(dǎo)致植物對(duì)這些差異產(chǎn)生不同解碼,最終做出不同的反應(yīng)。另外,相同條件下,不同濃度胞外Ca2+可能通過影響[Ca2+]cyt振