不同環(huán)節(jié)干片對免疫組化染色的影響

不同環(huán)節(jié)干片對免疫組化染色的影響

免疫組染色是病理診斷中非常重要的一種非常重要的輔助診斷方法，也是許多科學(xué)研究項(xiàng)目中應(yīng)使用的基本實(shí)驗(yàn)方法。此染色方法步驟較多,對染色結(jié)果的影響因素也較多,因此我們必須嚴(yán)格按照操作規(guī)范來進(jìn)行操作,以提供可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在實(shí)際操作中,老一輩的免疫組化工作者總是提醒我們不要“干片”。所謂“干片”,就是指在整個(gè)免疫組化染色過程中組織上覆蓋的液體(抗體、顯色液、蒸餾水、PBS(磷酸鹽緩沖液)等)由于揮發(fā)或在液體表面張力的作用下收縮,導(dǎo)致組織直接裸露在空氣中的情況,還有就是熱修復(fù)時(shí)修復(fù)液過少造成組織浸泡不到。干片會(huì)造成何種影響呢?下面我們以目前比較常用的非生物素試劑盒“Elivision-plus法”中的操作步驟進(jìn)行說明。先列出此方法具體步驟:(1)石蠟切片脫蠟和水化后,用PBS(pH7.4)沖洗3次,每次3分鐘;(2)根據(jù)一抗的要求,對組織抗原進(jìn)行微波修復(fù)、胃酶修復(fù)或EDTA修復(fù),蒸餾水洗一次,再用PBS沖洗3次,每次3分鐘;(3)每滴切片加50μ3%過氧化氫溶液,室溫下孵育10分鐘,PBS沖洗3次,每次3分鐘;(4)甩去PBS,每張切片加約50μl第一抗體,室溫下孵育60分鐘,PBS沖洗3次,每次5分鐘;(5)甩去PBS,每張切片加約50μl聚合物增強(qiáng)劑,室溫下孵育20分鐘,PBS沖洗3次,每次3分鐘;(6)甩去PBS,每張切片加約50μl酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物,室溫下孵育30分鐘,PBS沖洗3次,每次3分鐘;(7)甩去PBS,每張切片加約100μl新鮮配置的DAB顯色液,顯微鏡下觀察3~10分鐘,陽性顯色為棕色;(8)蒸餾水沖洗,再自來水沖洗,蘇木素復(fù)染2分鐘,1%鹽酸酒精分化3秒,自來水沖洗15分鐘返藍(lán);(9)由低到高梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。由以上步驟可以看出,免疫組化全程幾乎都與液體打交道。理想狀態(tài)下,組織片始終是處于一種濕潤狀態(tài)的,而為了保證組織濕潤,我們會(huì)把組織片放在“濕盒”中進(jìn)行孵育。在實(shí)際操作中,會(huì)有很多環(huán)節(jié)可能導(dǎo)致干片,具體分為幾種情況:一是修復(fù)時(shí)修復(fù)液過少造成組織浸泡不全;二是沖洗時(shí)放置時(shí)間過長或沖洗液過少造成干片;三是滴加試劑時(shí)忘記滴加或試劑不夠或滴加后忘記蓋上濕盒的蓋子造成干片。全程滴加的試劑分別是雙氧水(10min)、一抗(60min或室溫過中午或4℃過夜)、增強(qiáng)劑(20min)、聚合物(30min)、DAB顯色液(3~10min)、蘇木素(2min)。其中一抗是最重要也是孵育時(shí)間最長的一個(gè)環(huán)節(jié),如發(fā)生干片影響也最大。其余試劑大都孵育時(shí)間較短,只要滴加試劑量足夠,即便未放入濕盒也相對不易干片。因此我們在這一環(huán)節(jié)就選用一抗作為代表來研究干片造成的影響。1材料和方法1.1微波型抗體(1)隨機(jī)抽取本科室30例乳腺癌標(biāo)本,每例各切4張切片,分為4組。(2)福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供的ER濃縮型抗體,產(chǎn)品編號:RMA-0501,克隆號:SP1,預(yù)處理:高溫修復(fù)(檸檬酸),陽性部位:胞核。(3)家用750W格蘭仕微波爐一臺;(4)福州邁新公司提供的Elivision-plus試劑盒;(5)檸檬酸鹽抗原修復(fù)緩沖液(粉劑)(0.01M,pH6.0);(6)福州邁新公司提供的DAB試劑盒,DAB-0031;(7)酒精、二甲苯;蘇木素。1.2方法1.2.1第二組在修復(fù)時(shí)加入不足夠的修復(fù)液,及時(shí)對切片的干片第一組為對照組,按Elivision-plus正常步驟操作;第二組在修復(fù)時(shí)加入不足夠的修復(fù)液,人為造成干片;第三組在修復(fù)后直接將切片在空氣中晾干,人為造成干片;第四組在滴加一抗后并不蓋上濕盒的蓋子,造成干片。其余操作完全同第一組。1.2.2采用統(tǒng)計(jì)軟件spss130，卡方驗(yàn)證2干片對免疫組化的影響顯微鏡鏡下閱片,ER在乳腺癌細(xì)胞胞核呈現(xiàn)較均勻棕褐色著色。在胞核以外的部位出現(xiàn)類似深淺不一的棕褐色著色即為背景。陽性染色強(qiáng)度按照以下標(biāo)準(zhǔn):無陽性染色為-;弱陽性染色為+,較強(qiáng)陽性染色為++;最強(qiáng)陽性染色為+++。背景染色強(qiáng)度按照以下標(biāo)準(zhǔn):無背景染色為-;背景染色與弱陽性染色相當(dāng)為+;背景染色與較強(qiáng)陽性染色相當(dāng)為++。當(dāng)修復(fù)液不足時(shí),主要影響陽性表達(dá)。淹沒部分基本不影響,而未淹沒部分則造成干片,全部為陰性,分界明顯;但背景依然清晰,未受影響。修復(fù)后晾干與正常步驟操作的結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),對染色結(jié)果無影響。滴加一抗后如果干片,對染色結(jié)果影響很大(與正常操作步驟比較P<0.01)。本次試驗(yàn)雖然基本上也都有表達(dá),但總體偏弱,而且表達(dá)不均勻。少數(shù)地方強(qiáng),但大部分地方弱,某些局部甚至陰性。對背景影響尤為明顯,整張片子顯得比較黃而且不太透明,邊緣效應(yīng)也較常見。干片對免疫組化不同環(huán)節(jié)影響的情況見表1。染色結(jié)果如圖1~4所示。3免疫組化干片的修復(fù)和滴加抗體本次實(shí)驗(yàn)之所以選擇ER,是因?yàn)樗桥R床診斷最常應(yīng)用的抗體之一,是很成熟、表達(dá)很穩(wěn)定的抗體。它的表達(dá)部位在胞核,十分有利于觀察,也有利于區(qū)別背景著色?！安灰善笔敲庖呓M化操作中的一個(gè)原則,但大多書籍、文獻(xiàn)報(bào)道比較籠統(tǒng),缺乏細(xì)致的比較以區(qū)別對待。之所以要研究不同環(huán)節(jié)干片所造成的影響,就是想探索干片造成影響的原理,以方便我們更加正確和便捷地處理免疫組化操作。實(shí)驗(yàn)已證明,在修復(fù)環(huán)節(jié),是絕對不能干片的,因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致假陰性。修復(fù)液的pH值對修復(fù)效果影響顯著,未浸泡到部分雖然能達(dá)到相應(yīng)溫度,但無法滿足其要求的pH值環(huán)境?！靶迯?fù)后晾干”代表各個(gè)沖洗環(huán)節(jié),包括自來水洗、蒸餾水洗、PBS洗等。這些環(huán)節(jié)原本也不容易發(fā)生干片,只是在修復(fù)后滴加抗體前要先給玻片“畫圈”(即將組織周圍的水分擦干,然后用PAP筆(免疫組化筆)在組織周圍1~2mm的玻片上畫一個(gè)完整的圈,以防止滴加試劑后試劑向周圍流失),在這個(gè)過程中組織往往會(huì)部分干片。許多人擔(dān)心這會(huì)造成背景,其實(shí)大可不必?fù)?dān)心,事實(shí)證明此階段的干片對染色結(jié)果基本無影響。那么,我們以后在畫圈時(shí)也不必再要求“迅速、麻利”了。滴加抗體后,在張力作用下,抗體有向中間收縮的趨勢,加上試劑的邊緣揮發(fā)較快,水分揮發(fā)后,組織邊緣的抗體濃度實(shí)際上是增高了,因此染色會(huì)偏深,也容易出現(xiàn)非特異著色;如果邊緣揮發(fā)明顯,則會(huì)造成干片,可出現(xiàn)假陽性及很深的背景。在濕盒中由于濕度很大,基本能抑制液體揮發(fā)。一抗作用時(shí)間長,如果干片,局部試劑能