大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離

大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離產(chǎn)品簡(jiǎn)介1實(shí)訓(xùn)目標(biāo)2實(shí)訓(xùn)原理3實(shí)訓(xùn)試劑與設(shè)備4生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)5產(chǎn)品檢測(cè)6產(chǎn)品簡(jiǎn)介一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介SOD是SuperOxideDismutase縮寫，中文名稱超氧化物歧化酶，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動(dòng)物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標(biāo)；現(xiàn)已證實(shí)，由氧自由基引發(fā)的疾病多達(dá)60多種。它可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對(duì)細(xì)胞傷害。由于現(xiàn)代生活壓力，環(huán)境污染，各種輻射和超量運(yùn)動(dòng)都會(huì)造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化機(jī)制中SOD的地位越來(lái)越重要。大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離產(chǎn)品簡(jiǎn)介SOD類型：超氧化物歧化酶按其所含金屬輔基不同可分為三種：第一種是含銅（Cu）鋅（Zn）金屬輔基的稱（Cu.Zn—SOD），最為常見(jiàn)的一種酶，呈綠色，主要存在于機(jī)體細(xì)胞漿中；第二種是是含錳（Mn）金屬輔基的稱（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞內(nèi)；第三種是含鐵（Fe）金屬輔基的稱（Fe—SOD），呈黃褐色，存在于原核細(xì)胞中。大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離產(chǎn)品簡(jiǎn)介二、產(chǎn)品用途1、藥物類：主要集中在炎癥病患者，尤其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、心肌梗塞、心血管病、腫瘤患者以及放射性治療炎癥病患者；2、生化制藥：作為一種生化酶制劑，廣泛應(yīng)用于臨床和科研上，可抗衰老，抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)；3、化妝品：可添加在化妝品中，具有抗氧化抗腐蝕的優(yōu)良性能。以SOD為主要成份的化妝品風(fēng)靡世界，引發(fā)了化妝品歷史上的一場(chǎng)革命，使人類永葆青春美麗夢(mèng)想成真；保健食品、飲料：SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常暢銷。在飲料、糖果、糕點(diǎn)等食品中加入SOD既可利用其抗腐蝕性延長(zhǎng)保質(zhì)期，又可調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)。大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離實(shí)訓(xùn)目標(biāo)1.掌握有機(jī)溶劑沉淀法的原理和基本操作。2.掌握SOD酶提取分離的一般步驟。大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離實(shí)訓(xùn)原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）是一種具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可催化超氧負(fù)離子（O2-）進(jìn)行岐化反應(yīng)，生成氧和過(guò)氧化氫。大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有較豐富的SOD，通過(guò)組織和細(xì)胞破碎后，可用pH7.8的磷酸緩沖液提取出來(lái)。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出。有機(jī)溶劑沉淀的原理是有機(jī)溶劑能降低水溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子之間的靜電引力增大。同時(shí)，有機(jī)溶劑的親水性比溶質(zhì)分子的親水性強(qiáng)，它會(huì)搶奪本來(lái)與親水溶質(zhì)結(jié)合的自由水，破壞其表面的水化膜，導(dǎo)致溶質(zhì)分子之間的相互作用增大而發(fā)生聚集，從而沉淀析出。大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離實(shí)訓(xùn)試劑與設(shè)備一、試劑和材料新鮮蒜瓣，0.05mol/L磷酸緩沖溶液（pH7.8），氯仿-乙醇混合液（氯仿-無(wú)水乙醇3：5），丙酮（用前預(yù)冷至-10℃）。二、實(shí)驗(yàn)器材研缽，石英砂，燒杯（50mL），玻璃棒，pH計(jì)，冷凍離心機(jī)，離心管。大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)一、生產(chǎn)前準(zhǔn)備1、檢查生產(chǎn)原料、各種生產(chǎn)用試劑；2、檢查生產(chǎn)設(shè)備；3、檢查生產(chǎn)記錄等文件二、生產(chǎn)操作1、磷酸緩沖液制備粗酶液：將蒜瓣去外膜,于攪拌機(jī)中攪拌10min后移至研缽中研磨至蒜泥狀，加入3倍體積(mL/mg)的磷酸緩沖液,浸泡30~45min后用6層紗布抽濾.將濾渣再用2倍磷酸緩沖液浸泡30min后,6層紗布抽濾.如此反復(fù)共3次，收集3次抽濾所得濾液。采用熱變性法對(duì)粗酶液進(jìn)行粗提：將大蒜中SOD酶液于60℃熱處理20min,8500r/min離心10min,棄沉淀,取上清液。大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)3、采用丙酮沉淀法進(jìn)行分離純化：將酶液置于冰浴中,加入-18℃預(yù)冷的丙酮,攪拌10min,于4500r/min離心15min，棄上清液,用50mmol/L磷酸緩沖液溶解其沉淀后,透析磷酸緩沖液,4℃過(guò)夜,4500r/min離心10min,測(cè)定上清液的SOD酶活力。

大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離產(chǎn)品檢測(cè)一、檢測(cè)原理鄰苯三酚在酸性環(huán)境中穩(wěn)定，但在弱堿性環(huán)境中會(huì)發(fā)生自氧化反應(yīng),鄰苯三酚在自氧化時(shí)只接受一個(gè)電子生成超氧陰離子自由基(02+02一

),并在其自氧化過(guò)程中以一定速率產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物,SOD可以將02一歧化分解成H2O2和02,從而抑制了鄰苯三酚的自氧化速率。由此可以依據(jù)SOD分解02一的能力而間接推算SOD的活性(每分鐘反應(yīng)液中SOD抑制50%反應(yīng)速率時(shí)即為SOD活力單位)。大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離產(chǎn)品檢測(cè)二、實(shí)驗(yàn)試劑與器材

1、檢測(cè)試劑鄰苯三酚溶液:用10mmol/L的鹽酸溶液配制成45mmol/L的溶液，此溶液須臨用現(xiàn)配.Tris-HCI-EDTA緩沖液:配制50mmol/L的Tris-HCI緩沖液，內(nèi)含lmmol/L的EDTA溶液，調(diào)pH為8.2三、檢測(cè)器材試管、吸管、容量瓶、量筒、電子分析天平、比色皿、722型分光光度計(jì)。大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離產(chǎn)品檢測(cè)一、檢測(cè)前準(zhǔn)備1、檢測(cè)裝運(yùn)、各種檢測(cè)用試劑2、檢查檢測(cè)記錄等文件二、產(chǎn)品檢測(cè)1、樣品取樣品10g（精確至0.001）。用水浸泡或溶解定容至I00ml過(guò)濾，取濾液備用。2、鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定：取pH2的Tris-HCI-EDTA緩沖液4.5ml于10ml比色管中，于25℃恒溫10min，再加人25℃恒溫的45mmol/L的鄰苯三酚溶液10μl，混勻后迅速于Icm石英比色杯325nm波長(zhǎng)測(cè)光密度值，每隔30s測(cè)一次光密度值共測(cè)4min，求出鄰苯三酚的自氧化速率ODA/min。同時(shí)用10mmol/L的鹽酸做空白試驗(yàn)。大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離產(chǎn)品檢測(cè)2、SOD活性測(cè)定：取pH8.2