基因工程制藥技術(shù) 基因工程常用工具

生化制藥工藝AcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplan項(xiàng)目五基因工程制藥1基因工程的概念2基因工程操作工具3基因工程操作流程目錄CONTENTS基因工程常用工具02Part2基因工程操作工具一、基因工程操作工具1、基因工程操作要求基因的大小以納米計(jì)算，要對(duì)它進(jìn)行剪切、拼接等操作，沒(méi)有非常精細(xì)的工具是無(wú)法進(jìn)行的。2、基因工程操作工具“分子手術(shù)刀”----限制性核酸內(nèi)切酶

“分子縫合針”----DNA連接酶“分子運(yùn)輸車(chē)”----載體Part2基因工程操作工具二、限制性?xún)?nèi)切酶1、工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無(wú)53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基Part2基因工程操作工具二、限制性?xún)?nèi)切酶2、限制性?xún)?nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶分類(lèi)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA命名命名Hin

dⅢ

屬

種

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)第四個(gè)字母代表株羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序Part2基因工程操作工具二、限制性?xún)?nèi)切酶2、限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)----回文結(jié)構(gòu)（palindrome）雙鏈DNA中含有的二個(gè)結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列切口平端切口粘端切口GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Part2基因工程操作工具二、限制性?xún)?nèi)切酶2、限制性?xún)?nèi)切酶同功異源酶來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)GGATCCCCTAGG+BamHⅠGCCTAGGATCCGBstⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Part2基因工程操作工具二、限制性?xún)?nèi)切酶2、限制性?xún)?nèi)切酶同尾酶有些限制性?xún)?nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱(chēng)為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱(chēng)為配伍未端（compatibleend）BglⅡ+BamHⅠ+GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCGAGATCTTCTAGAATCTAGGATCTAPart2基因工程操作工具二、DNA連接酶1、DNA連接酶作用和分類(lèi)作用催化形成3,5-磷酸二酯鍵分類(lèi)E·coliDNA連接酶來(lái)源于大腸桿菌，可用于連接粘性末端T4DNA連接酶來(lái)源于T4噬菌體，可用于連接粘性末端和平末端，但連接效率低熱穩(wěn)定的DNA連接酶從嗜熱高溫放線菌（Thermoactinomycesthermophilus）菌株中分離純化的，一種能夠在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接作用的一種核酸酶Part2基因工程操作工具二、DNA連接酶2、不同的DNA連接酶對(duì)比連接酶底物輔助因子和激活因子溫度巰基試劑黏性末端平末端DNA-RNA雜合體RNA-RNA雜合體大腸桿菌DNA連接酶可行可行不行不行NAD+，Mg2+（1~3mmol/L）黏性末端：10~15℃補(bǔ)平缺口：37℃無(wú)T4DNA連接酶可行可行可行可行ATP，Mg2+（10mmol/L）黏性末端：4℃平末端：10~25℃補(bǔ)平缺口：37℃DTT嗜熱菌連接酶可行不行不行不行NAD+，Mg2+(10mmol/L)黏性末端：24~37℃補(bǔ)平缺口：65~72℃無(wú)Part2基因工程操作工具三、基因載體1、載體定義和分類(lèi)定義能攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子為什么要利用載體游離的DNA進(jìn)入細(xì)胞體,一般會(huì)直接被分解,就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄----翻譯成蛋白,游離DNA也無(wú)法跟著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制,導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因分類(lèi)克隆載體（cloningvector）為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體表達(dá)載體（expressionvector）為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體穿梭載體用于真核生物DNA片段在原核生物中克隆和鑒定（容易），然后在真核細(xì)胞宿主表達(dá)Part2基因工程操作工具三、基因載體2、載體選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)）即多個(gè)單一酶切位點(diǎn)分子量小，以容納較大的外源DNA3、常用載體