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一測多評法測定川芎、當歸中4種多指標成分

川藥和當歸通常用于中藥,歷史悠久。川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖38,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,別名芎穹、西芎、撫芎等;當歸為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根124。在化學成分上,兩者均含有機酸和內(nèi)酯類化合物,主要有阿魏酸、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、丁烯基苯酞等,這些成分均為川芎、當歸的有效成分。從功效來說,川芎偏于行氣散血,當歸偏于養(yǎng)血和血,兩者常配伍治療疾病,例如:腎氣丸、麻黃湯、升麻散、四物湯、桃仁湯、佛手散等,二藥伍用,互制其短而展其長,氣血兼顧,養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、行氣活血、散瘀止痛之力增強,為臨床常用補血活血藥對。目前多見以阿魏酸、藁本內(nèi)酯等為單一質(zhì)控指標同時控制川芎、當歸質(zhì)量的報道。Yu等建立了HPLC法快速測定川芎、當歸中阿魏酸松柏酯的含量;劉曉芳等建立了包含川芎、當歸在內(nèi)的7種中藥材中阿魏酸含量測定的方法;胡杰等建立了同時測定川芎、當歸中藁本內(nèi)酯含量的方法;劉云華等建立了同時測定川芎、當歸藥材中總阿魏酸的含量方法。采用一測多評方法同時測定同時控制川芎或當歸質(zhì)量的研究報道較為少見。劉云華等以丁基苯酞作為藁本內(nèi)酯的替代對照品,通過兩者之間校正因子的計算同時測定川芎藥材中的丁基苯酞和藁本內(nèi)酯的含量;張慧等測定了川芎中阿魏酸與洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、3-正丁烯苯酞的相對校正因子,并進行了含量測定。目前未見報道有同時建立川芎、當歸多指標化學成分一測多評的方法。基于川芎、當歸中部分主要有效化學成分相同,且洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對照品制備困難,而不同類型化合物之間一測多評方法已多有報道,為簡化檢測方法,在降低檢驗成本的同時,更加有效地控制川芎、當歸的質(zhì)量,擬按照“一測多評法建立的技術(shù)指南”技術(shù)要求,以阿魏酸為內(nèi)標,建立同時測定川芎飲片、當歸飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯4個化學成分含量的方法。經(jīng)方法學驗證,所建立的方法可用于川芎、當歸的質(zhì)量控制。Agilent1200型快速液相色譜儀,具有在線脫氣機、輸液泵、柱溫箱、紫外檢測器VWD、自動進樣器;ThermoFisherUltiMateue4d23000高效液相色譜儀,具有在線脫氣機、輸液泵、柱溫箱、DAD檢測器、自動進樣器;SartoriusCP225D電子分析天平(德國賽多利斯集團);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。1.2c73-13310、11937-2012-12復合材料對照品:阿魏酸(供含量測定用)、藁本內(nèi)酯(供薄層鑒別用,純度為95.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院,批號分別為0773-9910、111737-201204;洋川芎內(nèi)酯Ⅰ(純度≥98%)、洋川芎內(nèi)酯A(純度≥98%)均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號分別為130410、130428。Milli-Q超純水,乙腈、甲醇為色譜純,Merck。飲片來源:川芎飲片及當歸飲片均來自北京市多家飲片生產(chǎn)企業(yè),其中川芎飲片14批,酒川芎飲片10批,當歸飲片16批,酒當歸飲片10批。見表1。2.2溶液制備2.2.1混合對照溶液2.3方法研究2.3.1線性域研究2.3.2采用回歸因子計算2.4rcf因子精密吸取混合對照品溶液1、2、6、10、15、20μL進樣分析,計算以阿魏酸為內(nèi)標的洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的相對校正因子(RCF)。考察了Agilent1200、ThermoFisherUltiMateue4d130002種高效液相色譜系統(tǒng)和AgilentC18(4.6mm×150mm,3.5μm)、TechMateC18-STⅡ(4.6mm×250mm,5μm)、ThermoXLC18(4.6mm×150mm,5μm)3種不同品牌、規(guī)格的色譜柱,結(jié)果見表4。2.5外標法與外標法的比較取樣品按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,并按“2.1”項下色譜條件進行測定,利用“2.3.2”項下得到的平均相對校正因子計算川芎和當歸中洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯含量,并分別與外標法計算得到的含量進行比較,結(jié)果見表5、6。3討論3.1分離條件的確定考察流動相乙腈-不同濃度乙酸(0.10%、0.25%、0.50%和1.00%)、乙腈-不同濃度甲酸(0.10%、0.25%、0.50%和1.00%)、乙腈-水等9種溶劑系統(tǒng)對川芎、當歸中化學成分分離情況,結(jié)果采用乙腈-水溶劑系統(tǒng)時阿魏酸出峰不好,加酸后明顯變好,但以乙腈-1.00%甲酸分離效果最好;考察0.6、0.8、1.0mL·min-13種流速對分離效果的影響,結(jié)果以0.8mL·min-1時分離最好;考察35、30、25℃3種溫度對分離效果的影響,結(jié)果以25℃時分離最好。3.2濃度溶劑、提取方式對洋基肥內(nèi)酯提取率的影響考察30%、50%、70%甲醇和純甲醇4種溶劑分別超聲、回流30min的提取率。結(jié)果表明,超聲、回流對藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A的提取率影響不大,不同濃度溶劑對藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A提取率大小為:純甲醇略>70%甲醇>50%甲醇>30%甲醇;不同溶劑、不同提取方式對洋川芎內(nèi)酯Ⅰ提取率影響不大;超聲對阿魏酸的提取率較回流略低,相同提取方法、30%、50%、70%3種不同濃度甲醇對阿魏酸提取率差異不大,但純甲醇對阿魏酸提取率較30%、50%、70%甲醇要小很多。結(jié)合上述考察結(jié)果,考慮到中國藥典2010年版中川芎、當歸的阿魏酸含量測定采用的是70%甲醇回流提取方法,最后選擇70%甲醇回流30min。3.3測定阿魏酸、洋基肥、洋基肥內(nèi)標及其他本兩酯的含量研究中發(fā)現(xiàn)26批當歸飲片中,多數(shù)樣品未檢出洋川芎內(nèi)酯A,僅個別樣品中檢出微量川芎內(nèi)酯A。因此,針對當歸僅建立了以阿魏酸為內(nèi)標,測定阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ及藁本內(nèi)酯3種成分的一測多評方法。通過比較50份樣品,結(jié)果表明:川芎中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ及藁本內(nèi)酯含量遠高于當歸中這3個成分含量,且多數(shù)當歸飲片中未檢出洋川芎內(nèi)酯A,而在川芎中洋川芎內(nèi)酯A含量較高,與當歸產(chǎn)生明顯區(qū)別,可考慮從這一成分上對川芎、當歸進行鑒別。1儀器和試劑盒1.1儀器2方法和結(jié)果2.1標準曲線及方法檢出限采用AgilentZORBAXSB(4.6mm×150mm,3.5μm)色譜柱,流動相A為乙腈,流動相B為1%甲酸,梯度洗脫(0~10min,10%A→28%A;10~17min,28%A→45%A;17~25min,45%A→65%A;25~30min,65%A→100%A;30~35min,100%A;35~37min,100%A→10%A;37~45min,10%A),流速0.8mL·min-1,檢測波長280nm,柱溫25℃,自動進樣器進樣,進樣量10μL。HPLC圖見圖1。取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的對照品適量,精密稱定,置50mL量瓶中,加70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.3176、0.6034、0.6242、1.9908mg·mL-1的溶液。分別取上述對照品溶液0.30、0.17、0.73、0.23mL,置同一5mL量瓶中,加30%甲醇至刻度,搖勻,即得混合對照品溶液。2.2.2回歸方程的建立取飲片粉末(過4號篩)約0.2g,精密稱定,置100mL具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25mL,稱定重量,置水浴上加熱回流30min,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。精密吸取上述混合對照品溶液0.5、1、2、6、10、15、20μL,分別進樣分析。以進樣量對峰面積積分值進行回歸處理,得阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的回歸方程,結(jié)果表明各化學成分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,見表2。分別精密吸取混合對照品溶液各0.5,1,2,6,10,15,20μL,進樣,以阿魏酸為內(nèi)標,計算洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的校正因子,見表32.3.3加樣回收試驗分別取川芎飲片(批號20120508,No.3)和當歸(批號20120410,No.10)飲片的粉末,按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,連續(xù)進樣6次,測定,以相應(yīng)色譜峰的峰面積計算RSD,結(jié)果川芎飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的RSD(n=6)分別為0.15%、0.12%、0.43%、0.17%;當歸飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、藁本內(nèi)酯的RSD(n=6)分別為0.80%、0.36%、0.28%。表明該方法精密度良好。2.3.4加樣測定分別取同一批次川芎飲片(批號20120508,No.3)和當歸(批號20120410,No.10)飲片的粉末,按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液各6份,進樣測定。結(jié)果川芎飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯平均含量(n=6)分別為2.234、1.696、11.342、11.427mg·g-1,RSD分別為0.33%、0.10%、0.77%、0.37%;當歸飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、藁本內(nèi)酯平均含量(n=6)分別為0.746、0.244、3.850mg·g-1,RSD分別為0.97%、0.87%、0.70%。表明該方法重復性良好。2.3.5年生中國飲料分別取同一批次川芎飲片(批號20120508,No.3)和當歸(批號20120410,No.10)飲片的粉末,按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,分別在0、1、3、6、12、24h進樣,川芎飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD(n=6)分別為0.69%、0.76%、0.11%、0.33%;當歸飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD(n=6)分別為1.5%、0.83%、0.43%,結(jié)果表明川芎、當歸的供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.6對照品溶液的制備取已知含量的川芎飲片(批號20120508,No.3)和當歸(批號20120410,No.10)飲片的粉末均為0.1g各6份,精密稱定。川芎飲片中分別精密加入阿魏酸對照品溶液(0.2223mg·mL-1)1mL、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ對照品溶液(0.1690mg·mL-1)1mL、洋川芎內(nèi)酯A對照品溶液(0.3845mg·mL-1)3mL、藁本內(nèi)酯對照品溶液(0.2431mg·mL-1)5mL;當歸飲片中分別精密加入阿魏酸對照品溶液(0.0762mg·mL-1)1mL、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ對照品溶液(0.0241mg·mL-1)1mL和藁

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