一測(cè)多評(píng)法測(cè)定柴胡藥材中柴胡皂苷a、c、d的含量

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定柴胡藥材中柴胡皂苷a、c、d的含量

中醫(yī)的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制是制約中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國(guó)際發(fā)展的中心問(wèn)題之一。它也是中醫(yī)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。然而,由于中藥本身的復(fù)雜性,現(xiàn)行以單一活性成分或指標(biāo)成分定性定量分析為核心的質(zhì)量控制模式,已不能適應(yīng)全面控制中藥質(zhì)量的要求,多指標(biāo)綜合質(zhì)量控制模式已成為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制的發(fā)展趨勢(shì)。由于多指標(biāo)質(zhì)量控制模式需要足夠量的化學(xué)對(duì)照品,而中藥化學(xué)對(duì)照品分離難度大,有些單體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定難以分離或分離成本過(guò)高等因素,致使中藥多指標(biāo)成分質(zhì)量控制僅限于科研,在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中很難推廣。王智民等利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系,提出了“一測(cè)多評(píng)”的想法,即只測(cè)定1個(gè)成分(對(duì)照品易得者),來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成分(對(duì)照品沒(méi)有或難以供應(yīng))的同步監(jiān)控,并已成功運(yùn)用于木通3種有效成分及人參與三七藥材中多種人參皂苷含量的同步測(cè)定。中藥柴胡為傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(Bupleurum)植物,柴胡BupleurumchinenseDC.(北柴胡)及狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.(南柴胡)的干燥根,是一味療效顯著的常用中藥,其主要活性成分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及柴胡皂苷c,目前柴胡的質(zhì)量評(píng)價(jià)主要以這3種成分作為指標(biāo)。由于柴胡皂苷結(jié)構(gòu)復(fù)雜,在酸性條件下不穩(wěn)定等,其對(duì)照品制備難度非常大,致使柴胡藥材及制劑的質(zhì)量難以準(zhǔn)確控制。本文以柴胡皂苷a(SSa)作為對(duì)照品,建立柴胡皂苷a與柴胡皂苷d(SSd)及柴胡皂苷c(SSc)的相對(duì)校正因子,并用相對(duì)校正因子計(jì)算柴胡皂苷d及柴胡皂苷c的含量。以統(tǒng)計(jì)學(xué)t-檢驗(yàn)法對(duì)相對(duì)校正因子的計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較,對(duì)不同品牌色譜柱、不同廠家的高效液相色譜儀及不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行考察,綜合評(píng)價(jià)一測(cè)多評(píng)法在柴胡藥材中應(yīng)用的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。1儀器、藥品和成分配測(cè)定信息Waters系列高效液相色譜儀,包括:Waters600controller,Waters600pump,Waters2487dualabsorbancedetector,WatersEmpower工作站。電子分析天平(上海天平儀器廠),KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),乙腈、甲醇為色譜純(Fisher公司)。Wahaha純凈水(市售),提取用甲醇為分析純(北京化工廠)。柴胡皂苷a(批號(hào)110777-200406)和柴胡皂苷d(批號(hào)110778-200505)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,柴胡皂苷c由本實(shí)驗(yàn)室分離純化,HPLC(面積歸一化法)純度>98%。柴胡藥材收集自不同產(chǎn)地,經(jīng)作者鑒定為北柴胡B.chinenseDC.的干燥根。對(duì)照品結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。2方法和結(jié)果2.1測(cè)多評(píng)法確定各組分的含量在一定的線性范圍內(nèi)成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測(cè)器響應(yīng)成正比,即:W=f×A。在多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí),以藥材中某一典型組分(有對(duì)照品供應(yīng)者)為內(nèi)標(biāo),建立該組分與其他組分之間的相對(duì)校正因子,通過(guò)校正因子計(jì)算其他組分的含量。這種測(cè)定一個(gè)成分,實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成分定量的方法命名為一測(cè)多評(píng)法。假設(shè)某樣品中含有i個(gè)組分,存在Wi/Ai=fi(i=1,2,…,k,…,m)①。式中Ai為組分i的峰面積;Wi為i組分的量。選取其中一組分k為內(nèi)標(biāo),建立組分k與其他組分m之間的相對(duì)校正因子,有fkm=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak)②。由此可導(dǎo)出定量計(jì)算公式:Wm=(Wk×Am)/(fkm×Ak)③。式中Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積,Wk為內(nèi)標(biāo)物量;Am為組分m的峰面積,Wm為組分m的量。2.21個(gè)研究和多評(píng)價(jià)理論的研究2.2.1柱溫度a20a色譜柱為VenusiASB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脫(0～50min,25→90%A;50～55min,90→90%A;55～60min,90→25%A;60～70min,25→25%A);流速1.0ml·min-1;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。在上述色譜條件下,SSc,SSa,SSd與其它峰能達(dá)到較好的分離。對(duì)照品及樣品HPLC圖譜見(jiàn)圖2。2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱定柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對(duì)照品1.02,2.05,2.39mg置于同一2ml量瓶中,用色譜甲醇定容,制得混合對(duì)照品溶液,于4℃保存?zhèn)溆谩?.2.3超聲處理法取本品粉末(過(guò)60目篩)約0.5g,精密稱定,置50ml三角瓶中,加入5%氨水甲醇溶液25ml,密閉,于30℃水溫超聲處理30min,濾過(guò),濾渣用甲醇潤(rùn)洗兩次,每次10ml,合并濾液,回收甲醇至干。殘?jiān)蛹状?色譜純)溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中,過(guò)0.45mm的微孔濾膜,即得。2.2.4色譜條件分析精密吸取上述混合對(duì)照品溶液2,5,10,15,20μl注入高效液相色譜儀,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。分別以對(duì)照品量C(μg)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算,得柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性范圍(見(jiàn)表1),表明各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.2.5采用回歸因子計(jì)算以SSa為內(nèi)標(biāo),按“2.1”項(xiàng)下公式②,分別計(jì)算SSa對(duì)SSc和SSd的校正因子,見(jiàn)表2。2.2.6ssa和ssa峰面積的rsd精密吸取同一混合對(duì)照品溶液20μl,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄SSc,SSa和SSd的峰面積,其峰面積的RSD分別為1.40%,1.30%和1.47%。表明儀器精密度良好,符合含量測(cè)定要求。2.2.7ssa和ssa峰面積比較取同一供試品溶液20μl分別于0,2,4,6,8,10h進(jìn)樣測(cè)定,記錄SSc,SSa和SSd峰面積,其峰面積的RSD分別為1.70%,2.00%和2.10%。表明SSc、SSa和SSd在10h內(nèi)穩(wěn)定不變。2.2.8ssa和ssa含量的rsd稱取同一批柴胡藥材粉末(60目)約0.50g共6份,精密稱定,按供試品溶液處理方法制備樣品并測(cè)定,SSc,SSa和SSd含量的RSD(n=6)分別為1.20%,2.94%和2.87%。表明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性較好。2.2.9加樣回收率精密稱取已知含量的柴胡藥材粉末(60目)適量6份,分別加入一定量的SSa對(duì)照品,按供試品溶液處理方法制備樣品并測(cè)定,計(jì)算加樣回收率,SSa的平均回收率為101.64%,RSD(n=6)為2.33%。表明實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度符合要求。2.2.1高效液相色譜法分別精密吸取供試品、混合標(biāo)準(zhǔn)品各20μl注入高效液相色譜儀并測(cè)定。分別采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法計(jì)算柴胡藥材中SSc、SSa和SSd含量(見(jiàn)表3)。2.31-測(cè)量和多評(píng)估方法的耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性的評(píng)估2.3.1高效液相色譜條件的確定取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,進(jìn)樣2,5,10,15,20μl,測(cè)定,按“2.2.5”項(xiàng)下計(jì)算SSa對(duì)SSc和SSd的校正因子。實(shí)驗(yàn)考察了Waters600,Waters2690兩種高效液相色譜系統(tǒng)和VenusiASB-C18(4.6mm×250mm,5μm),VenusiMP-C18(4.6mm×250mm,5μm),HibarRT-C18(4.6mm×250mm,5μm)3種色譜柱。結(jié)果見(jiàn)表4。2.3.2實(shí)驗(yàn)室研究采用建立的一測(cè)多評(píng)分析方法在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)核實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異不大。見(jiàn)表5。2.4ssc與sd含量的比較采用統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn),對(duì)一測(cè)多評(píng)法與常規(guī)法得到的柴胡藥材SSc和SSd含量進(jìn)行比較,P>0.05,表明兩種方法測(cè)得含量沒(méi)有顯著性差異。3色譜峰的定位本實(shí)驗(yàn)通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證、方法耐用性、系統(tǒng)適應(yīng)性考察,對(duì)一測(cè)多評(píng)法用于柴胡藥材3種皂苷含量測(cè)定的技術(shù)適用性和應(yīng)用可行性進(jìn)行了探討。結(jié)果表明在不同色譜柱、不同儀器及不同實(shí)驗(yàn)條件下,柴胡皂苷a與柴胡皂苷c和柴胡皂苷d之間的相對(duì)校正因子(RCF)有較好的重現(xiàn)性(RSD分別為0.70%和0.56%)。用一測(cè)多評(píng)法計(jì)算的含量與常規(guī)的外標(biāo)法測(cè)得的含量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)t-檢驗(yàn)沒(méi)有顯著性差異,說(shuō)明本研究所得的SSa對(duì)SSc與SSd的校正因子具有普適性。在本研究的色譜條件下,柴胡藥材HPLC色譜圖中色譜峰比較簡(jiǎn)單,可以通過(guò)SSa與SSc和SSd之間的相對(duì)保留時(shí)間差進(jìn)行色譜峰定位,因此在定量柴胡皂苷a、c、d含量時(shí),只要有柴胡皂苷a一個(gè)對(duì)照品,即可通過(guò)該方法實(shí)現(xiàn)3種成分同步含量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)所得的相對(duì)保留時(shí)間差RTSSa-RTSSc和RTSSa-RTSSd的平均值分別為3.7185和-5.9955min,校正因子fSSa/SSc和fSSa/SSd的平均值分別為0.742和0.945,可供參考和使用。中藥化學(xué)成分非常復(fù)雜,在不同色譜條件下有不同的色譜峰,在同一色譜條件下,其色譜峰的數(shù)量、出峰時(shí)間及峰形等也受色譜柱、儀器及溶劑系統(tǒng)等多種因素影響,因此如何將待測(cè)色譜峰準(zhǔn)確定位,是“一測(cè)多評(píng)”方法能否成功應(yīng)用的關(guān)健問(wèn)題,需要進(jìn)行深入廣泛的研究。對(duì)于在一定色譜條件下,色譜峰相對(duì)較少的中藥,可根據(jù)《中藥注射劑色譜指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》推薦使用相對(duì)色譜保留時(shí)間作為定性依據(jù),根據(jù)內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間,加上相對(duì)保留時(shí)間差,再根據(jù)峰形,即能夠正確判斷出目標(biāo)峰的峰位置。本實(shí)驗(yàn)采用這種方法,效果良好。對(duì)于同一色譜條件下,色譜峰較復(fù)雜的中藥或復(fù)方制劑,可采用光譜相關(guān)色譜法進(jìn)行色譜峰的定位,同一組分在不同色譜柱及色譜儀器中的保留時(shí)間存在差異,但他