竹葉中黃酮提取工藝的研究

竹葉中黃酮提取工藝的研究

近年來，對氨基黃酮主要成分和主要藥理學(xué)活性的研究發(fā)現(xiàn)，它具有多種生物功能：調(diào)節(jié)血脂、抗脂質(zhì)過氧化、去除自由基、抗炎、抗菌、增強吸引力、抗硝化反應(yīng)、抗缺氧、冠狀動脈擴張血管、增加冠狀動脈擴張、增加心肌收縮能力、改善心肌和腦損傷、抗應(yīng)激和疲勞、抗輻射、抗菌和消炎等?？嘀?pleioblastusamarus)是喬本科竹亞科多年生常綠植物,高達4m,生于向陽山坡或山谷平原,廣泛分布在我國南方各省,安徽皖南盛產(chǎn)苦竹,苦竹資源已被開發(fā)利用,但竹葉多被遺棄.目前從竹葉中提取黃酮報道很多,但從苦竹葉中提取黃酮報道很少,本文以苦竹為對象,從苦竹葉中提取竹葉黃酮并通過一系列單因素試驗確定某一特定條件下的最佳提取條件,進而設(shè)計正交試驗,尋找提取苦竹中竹葉黃酮的最佳工藝條件.1材料和方法1.1樣品的制備和測定新鮮苦竹葉,2006年4月中旬采自安徽工程科技學(xué)院校園內(nèi),洗凈后經(jīng)恒溫鼓風(fēng)干燥箱60℃干燥12h,干燥后樣品經(jīng)粉碎機粉碎,過90目篩,收集粉末置于棕色試劑瓶中待用.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥95%,國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、石油醚、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉,所有試劑均為分析純.1.2儀器DHG-9134BS-Ⅲ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司),721分光光度計及其配套設(shè)備(上海精密科學(xué)儀器有限公司),HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司),RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠),80-2型離心機(常州國華電器有限公司),SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州市上街華科儀器廠).1.3黃酮總濃度的決定(1)搖勻和放置mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品到小燒杯中,用30%乙醇于100mL容量瓶定容,即得500μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液.首先找出蘆丁最大吸收峰,用移液管準(zhǔn)確吸取10mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液分別置于50mL的容量瓶中,用30%的乙醇溶液補充至約25mL,先加5%的NaNO2溶液1.4mL,搖勻,放置5min;再加10%的Al(NO3)3溶液1.4mL,搖勻,放置6min,再加入1mol/L的NaOH溶液10mL,用30%的乙醇溶液定容到刻度,靜置20min后在495~520nm波長測定樣品吸光度,找出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液處于最大吸收峰時的波長,試劑空白為參比液.結(jié)果表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液樣品在510nm處有最大吸收峰.再做蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,用移液管準(zhǔn)確吸取1.0mL,2.0mL,4.0mL,6.0mL,8.0mL,10.0mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液分別置于50mL的容量瓶中,以上述同樣的配制方法,在510nm處測定各樣品吸光度,最后以吸光度A值對濃度C(μg/mL)進行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:y=0.0117x?0.0022,R2=0.9999.y=0.0117x-0.0022,R2=0.9999.由圖1可見曲線線性關(guān)系良好.(2)粗黃酮的提取g,用濾紙包好置于索氏提取器內(nèi),水浴鍋內(nèi)加熱回流抽提,直至抽提液呈無色為止.抽提結(jié)束后取出濾紙包自然風(fēng)干,再將竹葉粉末移至平底燒瓶中,加入一定濃度的乙醇溶液在一定條件下回流浸提.浸提結(jié)束后,立刻抽濾并收集濾液.將濾液轉(zhuǎn)至蒸發(fā)瓶中,減壓濃縮分離乙醇.將濃縮液轉(zhuǎn)至50mL容量瓶中,冷卻至室溫后,以蒸餾水定容至刻度.定容后的溶液,于離心機中離心除去少量葉綠素及其他水不溶性雜質(zhì).用膠頭滴管小心吸取約20mL上清液于分液漏斗中,加入約20mL的石油醚充分振蕩,靜置分層后,上層液為石油醚,下層為樣品提取液.萃取一到兩次,至上層液無色或微有顏色即可.最后從分液漏斗下端放出約10~15mL樣品提取液于干燥的小燒杯中,即為待測的粗黃酮水溶液.用移液管準(zhǔn)確移取2mL待測的粗黃酮水溶液至50mL容量瓶中,用30%的乙醇溶液補充至約25mL,先加入5%的NaNO2溶液1.4mL,搖勻后放置5min;再加入10%的Al(NO3)3溶液1.4mL,搖勻后放置6min,再加入1mol/L的NaOH溶液10mL,用30%乙醇定容到刻度,靜置20min后再離心分離花色苷絡(luò)合物沉淀,最后取上清液在510nm處測定樣品吸光度.2提取技術(shù)的研究2.1單一因素對黃酮提取效果的影響(1)乙醇濃度的確定g.按竹葉黃酮的提取與測定所述操作,在一定的條件下,分別用50%、60%、70%、80%的乙醇浸提竹葉樣品.結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇體積分數(shù)在60%時,樣品提取測得的吸光度值最大,因此以60%的乙醇為最佳.(2)不同浸提溫度對提取效果的影響g.按竹葉黃酮的提取與測定所述操作,在一定的條件下,準(zhǔn)備4個水浴鍋,分別將溫度設(shè)定為50℃、60℃、70℃、80℃后浸提竹葉樣品.結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度在70℃時,樣品提取測得的吸光度值最大,因此浸提溫度以70℃最佳.(3)不同浸提時間對提取效果的影響g.按竹葉黃酮的提取與測定所述操作,在一定的條件下,以浸提時間分別為1h、2h、3h、4h浸提竹葉樣品.結(jié)果發(fā)現(xiàn)時間在3h時,樣品提取測得的吸光度值最大,因此以浸提時間3h為最佳.(4)不同固液比對竹林葉片提取效果的影響按竹葉黃酮的提取與測定所述操作,在一定的條件下,分別以固液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(即37.5mL、50mL、62.5mL、75mL)浸提竹葉樣品,結(jié)果發(fā)現(xiàn)固液比在1∶20(即50mL)時,樣品提取測得的吸光度值最大,因此以固液比1∶20最佳.2.2不同工藝條件對竹材浸提率的影響(1)多因素正交試驗.探討了各因素對竹葉總黃酮提出率的影響后,再對溶劑濃度、浸提溫度、浸提時間、固液比進行綜合評價,分別準(zhǔn)確稱取9份2.5g制備好的竹葉粉末,以同樣的操作方法安排4因素3水平的正交試驗,試驗方案查L9(34)正交試驗表可得.試驗因素及水平正交實驗如表1所示.表2是以乙醇為溶劑,不同工藝條件下竹葉總黃酮的浸提結(jié)果.其中k為平均因素水平.由k值及極差R可得最佳試驗方案:D3A3B2C2.(2)驗證性試驗及重現(xiàn)性試驗.在此條件下,準(zhǔn)確稱取4份2.5g制備好的竹葉粉末,用前述的操作步驟提取測定樣品進行驗證,分別測得其吸光度值,測得數(shù)據(jù)如表3所示.3苦竹葉黃酮提取的最佳工藝條件(1)由正交可知最佳試驗方案為D3A3B2C2,即在浸提溫度為70℃時用15倍原料的70%的乙醇浸提3h,在此條件下,用竹葉黃酮的提取與測定所述的操作步驟提取測定4組樣品進行驗證,測得其吸光度值取平均值為0.408,較正交試驗9組中任意一組都要大,證明試驗得出的最佳方案有效.(2)采用化學(xué)比色法測定竹葉提取物總黃酮含量時,在測定過程中提取液中含有的原花色素等雜質(zhì)會產(chǎn)生紅色絮狀沉淀,嚴重干擾吸光度的測量,使測定結(jié)果極不穩(wěn)定,而且通常偏大,本實驗在對竹葉黃酮的測定中,靜置離心分離絮狀沉淀,通過實驗發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)僅為3.2%,遠小于10%,測定的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好,吸光度測量值十分穩(wěn)定.(3)由極差大小可知A、B、C、D四個因素對結(jié)果影響主次順序為D>A>B>C,因此,在進行苦竹葉黃酮提取時,要對浸提溶劑的固液比加以嚴格控制,同時也要考慮到乙醇濃度和浸提溫度等帶來的影響.(4)由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線公式y(tǒng)=0.0