自噬是一種生理機(jī)制

自噬是一種生理機(jī)制

自食（自我消化）是通過降低自身的細(xì)胞和細(xì)胞器官進(jìn)行一系列生化過程，以實(shí)現(xiàn)真核細(xì)胞的“自我消化”。在這個(gè)過程中,首先是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器被雙層膜包裹形成自噬泡,然后再與溶酶體融合形成自噬溶酶體,最終使被包裹的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器降解。自噬主要有3個(gè)功能:①自噬是對營養(yǎng)缺乏的一種適應(yīng)性的反應(yīng)。當(dāng)營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨基酸減少時(shí)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,以維持細(xì)胞的正常代謝。②自噬參與穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)內(nèi)環(huán)境的管理。它控制過氧化物酶體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的更新。③自噬參與一定的組織特異性融合。自噬既可以作為一種防御機(jī)制來抵御環(huán)境變化對細(xì)胞造成的損傷,同時(shí)它作為一種細(xì)胞的死亡程序,又可以誘導(dǎo)細(xì)胞主動性的死亡。這種雙重機(jī)制使其在腫瘤細(xì)胞中也產(chǎn)生不同的作用。作為Ⅱ型的程序性細(xì)胞死亡——自噬,在某些時(shí)候與Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡——凋亡有著密不可分的聯(lián)系,這就使在研究抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細(xì)胞自噬時(shí)也必須考慮這些因素。1腫瘤細(xì)胞的自排斥1.1突變前后腫瘤細(xì)胞的自噬能力和細(xì)胞系統(tǒng)的變化從上世紀(jì)70年代末期開始,人們逐漸認(rèn)識到腫瘤細(xì)胞的自噬能力低于同樣部位正常細(xì)胞的自噬能力,而且在營養(yǎng)缺乏或者細(xì)胞高密度的情況下,腫瘤細(xì)胞的自噬能力也不會增加。這就使人們將細(xì)胞自噬能力的減少同腫瘤的發(fā)生聯(lián)系了起來。隨后,在腫瘤的動物模型中也觀察到了這種現(xiàn)象。在對不同腫瘤細(xì)胞發(fā)展過程的研究中發(fā)現(xiàn),有些腫瘤細(xì)胞,如化學(xué)致癌物導(dǎo)致的肝癌細(xì)胞,在癌變前期的肝結(jié)節(jié)時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)了自噬能力下降的現(xiàn)象。而鼠的胰腺細(xì)胞經(jīng)致癌物質(zhì)誘導(dǎo)后,在癌變前期的結(jié)節(jié)和形成腺瘤的時(shí)候自噬和降解能力是增加的,當(dāng)形成癌細(xì)胞時(shí),自噬能力反而減少。這些例子說明大多數(shù)腫瘤細(xì)胞(如:肝、胰腺、乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同,但是在癌變之后其自噬能力均減弱。自噬能力的衰退可能有利于腫瘤的發(fā)展。這提示腫瘤細(xì)胞之所以能快速生長,是由于它打破了細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率與自噬體降解蛋白質(zhì)的平衡。為此,越來越多的研究者從誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的角度去觀察抗腫瘤藥物作用的分子機(jī)制。1.2血清/氨基酸的濃度盡管大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的自噬活性都降低,但是仍然有一些腫瘤細(xì)胞保持了較高的自噬活性,如大腸癌、肺癌細(xì)胞及人宮頸癌HeLa細(xì)胞等。研究表明,在缺乏血清或氨基酸的情況下約3h,HeLa細(xì)胞中的自噬部分從4%上升到37%。這些腫瘤細(xì)胞所具有的高自噬活性對腫瘤細(xì)胞在惡劣環(huán)境中的生存起到了一定的保護(hù)作用,也可能使一些抗腫瘤藥物的作用減弱。2對藥物過程導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制雖然目前知道一些抗腫瘤藥物可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的產(chǎn)生,但是由于自噬的雙重機(jī)制以及自噬和凋亡之間的密切聯(lián)系,從而對于某些藥物最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的分子機(jī)制尚不能肯定。2.1由于自蝕激活，腫瘤細(xì)胞死亡2.1.1胞自噬作用如:他莫昔芬(tamoxifen)對乳腺癌MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生的自噬作用?？鄥A(matrine)可以引起肝癌細(xì)胞HepG2形成自噬小體。盼生安(panshengan)對BEL-7402肝癌細(xì)胞的作用中也可看到自噬的產(chǎn)生。2.1.2氧化二砷誘導(dǎo)凋亡如:三氧化二砷(As2O3)在低濃度(2μm)時(shí),誘導(dǎo)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡方式是自噬,這一濃度還不會出現(xiàn)骨髓抑制和嚴(yán)重的副作用。而三氧化二砷在高濃度時(shí)(8～16μm)則是通過誘導(dǎo)凋亡導(dǎo)致細(xì)胞死亡。對于APL(急性早幼粒細(xì)胞白血病)細(xì)胞系,低濃度的三氧化二砷(1μm)就誘導(dǎo)了它們的凋亡。同樣,白藜蘆醇(resveratrol)在低濃度時(shí)(50μm),通過誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡,而它殺死前列腺癌細(xì)胞的作用主要是通過凋亡途徑。2.1.3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬長春新堿(vincristine)可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2的自噬性凋亡。這種細(xì)胞凋亡有著明顯的自噬特征。據(jù)報(bào)道,長春堿類抗腫瘤藥可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生,也能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同樣,蘆薈大黃素(aloeemodin)在對鼠的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用中,除了可以引起caspase依賴性的凋亡外,還可促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)酸性囊泡的形成,這說明了在蘆薈大黃素的作用下,鼠的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞也可以進(jìn)行自噬性的死亡。2.2誘導(dǎo)細(xì)胞增殖自噬作用既可以啟動自噬性的死亡程序抑制腫瘤的發(fā)展,同時(shí)它也是腫瘤細(xì)胞的一種適應(yīng)性反應(yīng),保護(hù)腫瘤細(xì)胞,防止?fàn)I養(yǎng)缺乏和藥物帶來的損害。在已知的可以產(chǎn)生自噬作用的抗腫瘤藥物中,大部分藥物在適當(dāng)濃度(誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生)時(shí)就可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)它們死亡。但是有一些藥物在可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬的濃度時(shí),并沒有引起細(xì)胞的死亡。如temozolomide(替莫唑胺),是一種新的烷化劑,用其處理惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373-MG時(shí)發(fā)現(xiàn)有自噬產(chǎn)生。使用濃度為100μm的temozolomide,3d后,可以看到U373-MG細(xì)胞中有明顯的自噬特征,而且細(xì)胞的增殖受到抑制。但作用7d后卻發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始增殖。這說明了該物質(zhì)誘導(dǎo)的自噬是可逆的,而且這種自噬可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞,防止其死亡。由于自噬在腫瘤細(xì)胞中具有雙重機(jī)制,因此,在研究抗腫瘤藥物時(shí),要從正反兩方面去看待腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生自噬作用。2.3口皮細(xì)胞自噬,所見表4研究發(fā)現(xiàn)有些抗腫瘤藥物也能誘導(dǎo)正常細(xì)胞的自噬。如5-FU(5-氟脲嘧啶)可以誘導(dǎo)口腔上皮角質(zhì)化細(xì)胞的自噬,通過自噬降解使正常的上皮細(xì)胞發(fā)生變化,這可能與5-FU這類化療藥會引起機(jī)體的不良反應(yīng)之——粘膜炎有關(guān)。3bnip3和lc3在腫瘤形成的過程中,參與細(xì)胞自噬調(diào)控的多種基因發(fā)生異常,從而導(dǎo)致細(xì)胞自噬能力的下調(diào)?？鼓[瘤藥物可以通過調(diào)整這些異常的基因提高腫瘤細(xì)胞的自噬。如:Beclin-1是酵母Atg6/Vps30的同系物,能和Atg14,Vps34/class3PI3kinase,Vps15共同形成一個(gè)多聚體復(fù)合物.這個(gè)復(fù)合物在自噬體的形成過程中起到一個(gè)關(guān)鍵的作用。Beclin-1作為一種哺乳動物的自噬基因,可以控制細(xì)胞的生長,抑制腫瘤的發(fā)生。這一作用的產(chǎn)生與它包含有豐富亮氨酸核輸出信號的結(jié)構(gòu)域有關(guān)。在40%～75%的彌散性乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞中,都有Beclin-1的單等位基因缺失。在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中,增加Beclin-1的表達(dá)可以促進(jìn)自噬,抑制MCF-7細(xì)胞的增殖。使用他莫昔芬處理MCF-7細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),可以增加Beclin-1的表達(dá),這也從分子機(jī)制上論證了他莫昔芬可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的產(chǎn)生。作為Bcl-2家族中的一員,BNIP3(Bcl-2/腺病毒E1B19-ku相互作用蛋白3),它擁有Bcl-2同源3功能區(qū),在細(xì)胞被誘導(dǎo)發(fā)生死亡的過程中,它能夠完全與線粒體的外膜整合,引起線粒體通透性的轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放,它的高表達(dá)可以引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡——自噬性死亡。因此在三氧化二砷誘導(dǎo)的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬性死亡的過程中,BNIP3發(fā)揮著重要的作用。三氧化二砷是通過上調(diào)線粒體的細(xì)胞死亡蛋白BNIP3,來誘導(dǎo)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬性死亡。LC3(微管相關(guān)蛋白1lightchain3),最初是從鼠的大腦中與微管相關(guān)蛋白1A和1B一起提純時(shí)被發(fā)現(xiàn)的,它是酵母Apg8/Aut7p的同系物。在酵母中,Apg8/Aut7p對于自噬體的形成起到了重要的作用。LC3現(xiàn)已作為自噬體的特異性標(biāo)記蛋白。當(dāng)哺乳動物的細(xì)胞有自噬發(fā)生時(shí),LC3-Ⅰ脂質(zhì)化形成LC3-Ⅱ,定位于自噬體膜,這些定位能夠通過和綠色熒光蛋白或其衍生物結(jié)合,形成嵌合蛋白來進(jìn)行觀測。使用抗腫瘤藥物處理腫瘤細(xì)胞時(shí)也可以看到這一現(xiàn)象。如用長春堿(vinblastine)處理饑餓的HeLa細(xì)胞時(shí),可以看到,LC3的量比不用該藥處理時(shí)產(chǎn)生LC3的量明顯增多。在用temozolomide處理惡性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)LC3-陽性自噬泡數(shù)量也明顯增多。這不僅說明了這些抗腫瘤藥物可以激發(fā)腫瘤細(xì)胞的自噬,同時(shí)也指出了這些腫瘤藥物參與了自噬分子的調(diào)控。TOR(targetofrapamycin)蛋白屬于磷脂酰激酶相關(guān)激酶(PIKKs)家族,它可以調(diào)節(jié)翻譯的啟動和延長、核糖體的生物合成、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、與代謝途徑有關(guān)的酶的轉(zhuǎn)錄和自噬。TOR通過感受細(xì)胞內(nèi)氨基酸和ATP的量來調(diào)節(jié)自噬,因此又被認(rèn)為是自噬啟動的門戶。它活化時(shí)抑制自噬的發(fā)生。雷帕霉素(rapamycin)可以抑制TOR的活性,從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。雷帕霉素是一種抗真菌藥物和免疫抑制劑,同時(shí)它還具有抗腫瘤的活性,現(xiàn)在正在對癌癥患者進(jìn)行Ⅱ期和Ⅲ期的臨床試驗(yàn)。已經(jīng)有研究證實(shí)雷帕霉素和它的派生物(CCI-779,RAD001andAP23576)在多種惡性腫瘤中可以抑制mTOR(mammaliantargetofrapamycin)的功能,并且產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的作用。至于雷帕霉素是否可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬,目前還未見相關(guān)報(bào)道。研究抗腫瘤藥物參與自噬的分子調(diào)控,有助于進(jìn)一步了解自噬與抗腫瘤藥物之間的關(guān)系,也為研究抗腫瘤藥物的作用機(jī)制開辟了一個(gè)更為廣闊的空間。4常見的抗腫瘤藥物近年來,隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步和分子藥理的深入探索,為惡性腫瘤的藥物治療提供了不少新靶點(diǎn),抗腫瘤藥正從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物向針對多環(huán)節(jié)作用的新型抗腫瘤藥物發(fā)展。其中一些具有新靶點(diǎn)的抗腫瘤藥與自噬也存在著一定的關(guān)系。4.1內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用腫瘤內(nèi)的血管是新生的,腫瘤可通過這些新生的血管實(shí)現(xiàn)腫瘤間質(zhì)的血管化,并在腫瘤的生長和擴(kuò)散中起重要的作用。近年來腫瘤新生血管生成抑制劑已成為抗腫瘤藥的新靶點(diǎn)。腫瘤內(nèi)出現(xiàn)血管后,除了血管帶給瘤細(xì)胞營養(yǎng)外,內(nèi)皮細(xì)胞本身對瘤細(xì)胞也有旁分泌刺激作用。腫瘤新生血管的旁分泌效應(yīng)源于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的生長因子和細(xì)胞因子,它們刺激腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。Endostatin(內(nèi)皮抑素)通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖,阻止血管生成而發(fā)揮抗腫瘤作用。Chau等通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),用Endostatin誘導(dǎo)EAhy926人內(nèi)皮細(xì)胞的死亡主要是自噬性的死亡。電鏡下觀察Endostatin作用于人內(nèi)皮細(xì)胞6～24h后就可見大量的自噬泡。Endostatin產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用不依賴于caspase途徑和氧化途徑,但可被3-MA(一種特異的自噬抑制劑)和亮肽素,抑酞酶(絲氨酸,半胱氨酸溶酶體蛋白抑制劑)所調(diào)控。4.2產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞自噬腫瘤分化誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞分化為正常或接近于正常的細(xì)胞,從而使它們出現(xiàn)類似正常細(xì)胞的表型或恢復(fù)正常細(xì)胞的某此功能。但是這些分化誘導(dǎo)劑也可以引起某些腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象。如:維生素D(VitaminD)和類似物可以誘導(dǎo)處于G1/G2期的白血病細(xì)胞向成熟階段分化,阻遏細(xì)胞進(jìn)入S期。同時(shí)它們還能抑制乳腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌的生長。在研究VitaminD的類似物EB1089對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的作用時(shí)發(fā)現(xiàn),它殺死MCF-7細(xì)胞時(shí)并不依賴于caspase,但是它也能引起染色質(zhì)凝聚和DNA斷裂。實(shí)驗(yàn)證實(shí),在EB1089的這種啟動核凋亡的作用中包括了依賴Beclin1的自噬途徑。4.3crolxin抑制劑細(xì)胞信號在傳導(dǎo)過程中發(fā)生障礙或異常就會導(dǎo)致惡性腫瘤增殖、無限生長。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶點(diǎn)包括信號蛋白構(gòu)象、配基受體結(jié)合信號蛋白以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵酶等。表皮生長因子受體(EGFR)屬于酪氨酸激酶受體,它在乳腺癌、卵巢癌、喉癌、食道癌、腦腫瘤等中都有過量表達(dá)。響尾蛇毒(crotoxin)為美洲響尾蛇毒液的提取物,Nicholas等使用了不同的鱗狀癌細(xì)胞(這些癌細(xì)胞表達(dá)EGFR水平不同)來觀測crotoxin對它們的抑制作用,發(fā)現(xiàn)crotoxin抑制高表達(dá)EGFR的細(xì)胞生長最有效。從而說明了crotoxin對高表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞有高度的選擇性抑制作用。由于其對多種腫瘤細(xì)胞有作用,現(xiàn)在正在對患有實(shí)體瘤并且用常規(guī)治療難以控制的病人進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)。我們實(shí)驗(yàn)室使用crotoxin處理慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7時(shí)發(fā)現(xiàn),它在引起這兩種細(xì)胞死亡的過程中啟動了自噬。5出現(xiàn)非自噬的藥物自噬是一種生理機(jī)制,它在抗腫瘤藥物作用于腫瘤細(xì)胞的過程中也會發(fā)生。抗腫瘤藥物引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬與藥物的種類、腫瘤細(xì)胞的類型、藥物的濃度、藥物作用細(xì)胞的時(shí)間等因素有關(guān)。由于自噬的特點(diǎn),藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬后會出現(xiàn)兩種不同的結(jié)果:一種是保護(hù)細(xì)胞防止周圍環(huán)境帶來的損害;另一種是啟動細(xì)胞主動性的Ⅱ型細(xì)胞死亡程序。目前,對于這兩種不同結(jié)果的