枸杞多糖對(duì)uva輻射致體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

枸杞多糖對(duì)uva輻射致體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

隨著臭氧層的逐漸減小，人類(lèi)接觸的紫外強(qiáng)度不斷增加。過(guò)度暴露于紫外線(xiàn)輻射與多種健康問(wèn)題有關(guān),最常見(jiàn)的是皮膚癌和白內(nèi)障,因此,由紫外線(xiàn)所引起的疾病負(fù)擔(dān)不斷增加。以往研究多集中于中波紫外線(xiàn)對(duì)人皮膚的損傷,而對(duì)長(zhǎng)波紫外線(xiàn)(UVA,320~400nm)的研究較少。在陽(yáng)光紫外輻射中,UVA占紫外輻射總能量的95%。與中波紫外線(xiàn)相比,UVA具有更強(qiáng)的穿透力,可達(dá)到皮膚的真皮層,引起體外培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。同時(shí),UVA在皮膚光老化的發(fā)生和發(fā)展中也起著重要作用。UVA照射細(xì)胞后,產(chǎn)生各種氧自由基,通過(guò)引起脂質(zhì)過(guò)氧化而損傷多種細(xì)胞膜相結(jié)構(gòu),進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡和基因的改變或突變。為減輕紫外線(xiàn)對(duì)人體的損傷,除了遮蓋皮膚以防紫外線(xiàn)照射外,應(yīng)用抗氧化劑已成為人們的必然選擇,尋找更為有效的抗氧化、抗紫外線(xiàn)輻射劑更是成為目前的研究熱點(diǎn)。枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharides,LBP)是從茄科植物寧夏枸杞中提取出來(lái)的生物活力多糖,有研究表明,它具有抗氧化、清除氧自由基的作用。筆者以體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象,在體外成功建立成纖維細(xì)胞UVA損傷模型,觀(guān)察枸杞多糖對(duì)UVA損傷成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1皮膚正常年齡要求取自無(wú)菌狀態(tài)下“包皮環(huán)切術(shù)”所切除的正常皮膚,要求供皮者年齡為10~30歲,無(wú)瘢痕體質(zhì)。將皮膚置于75%的乙醇中漂洗數(shù)次,迅速浸入含有低濃度雙抗的PBS中。1.1.2u3000試劑UVA型紫外輻射計(jì)(北京師范大學(xué)光電儀器廠(chǎng)生產(chǎn),波長(zhǎng)范圍320~400nm,波峰365nm),UVA燈管,MK3型酶標(biāo)儀(Lab公司),722型分光光度計(jì)。LBP(純度為66.7%,購(gòu)于寧夏中藥廠(chǎng)),用DMEM培養(yǎng)基配制,現(xiàn)用現(xiàn)配,過(guò)濾除菌。DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司),胎牛血清(Gibico公司),胰蛋白酶(美國(guó)AMORESCO公司),四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,美國(guó)Sigma公司);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程公司。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及培養(yǎng)皮膚在無(wú)菌條件下去除皮下組織,漂洗,剪成0.5cm×0.5cm,置于培養(yǎng)皿中,加入0.25%的胰酶消化過(guò)夜。次日分離表、真皮。采用“植塊培養(yǎng)法”培養(yǎng),培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素鈉、100mg/ml硫酸鏈霉素),于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合時(shí),按體積比為1∶2的胰酶∶EDTA消化細(xì)胞,按1瓶細(xì)胞傳代成3(4)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3~8代細(xì)胞。1.2.2uva動(dòng)態(tài)照射法取傳代純化后指數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml,接種于96孔板上,每孔100μl,隨機(jī)分為6組,即正常對(duì)照組、UVA模型組、UVA+0.1mg/mlLBP組、UVA+0.2mg/mlLBP組、UVA+0.4mg/mlLBP組、UVA+0.8mg/mlLBP組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后,UVA模型組單純給予紫外線(xiàn)照射,各枸杞多糖保護(hù)組于紫外線(xiàn)照射前2h加入不同濃度的LBP,對(duì)照組和模型組只加入相同量的培養(yǎng)基,紫外線(xiàn)照射前吸取培養(yǎng)基,用D-hanks液清洗2次,并鋪上一薄層D-hanks液,在紫外燈下照射,以2支平行UVA燈管作為UVA光源,距離臺(tái)面15cm,輻射強(qiáng)度為1mW/cm2,照射時(shí)間為2400s,總劑量為2.4J/cm2。照射后各孔重新加入原來(lái)的培養(yǎng)液,再加入5mg/ml的MTT20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄去上清液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl,37℃條件下振蕩15min,用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(A)值。1.2.3uva的測(cè)定取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml左右,接種至6個(gè)直徑為100mm的培養(yǎng)皿中,每皿5ml。隨機(jī)分為6組,即正常對(duì)照組、UVA模型組、UVA+0.1mg/mlLBP組、UVA+0.2mg/mlLBP組、UVA+0.4mg/mlLBP組、UVA+0.8mg/mlLBP組。各枸杞多糖保護(hù)組于紫外線(xiàn)照射前2h加入不同濃度的LBP,正常對(duì)照組和U-VA模型組只加入相同量的培養(yǎng)基。紫外線(xiàn)照射前吸取培養(yǎng)基,用D-hanks液清洗2次,并鋪上一薄層D-hanks液,在紫外燈下照射,以2支平行UVA燈管作為UVA光源,距離臺(tái)面15cm,輻射強(qiáng)度為1mW/cm2,照射時(shí)間為2400s,總劑量為2.4J/cm2。照射完畢后,把原來(lái)吸掉的培養(yǎng)基重新加入各培養(yǎng)皿中,繼續(xù)培養(yǎng)4h,離心收集細(xì)胞,用冷PBS清洗2次,超聲破碎細(xì)胞,取裂解液一式3份,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SOD活力、MDA含量。1.2.4uva的測(cè)定取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml左右,接種至6個(gè)直徑為100mm的培養(yǎng)皿中,每皿5ml。隨機(jī)分為6組,即正常對(duì)照組、UVA模型組、UVA+0.1mg/mlLBP組、UVA+0.2mg/mlLBP組、UVA+0.4mg/mlLBP組、UVA+0.8mg/mlLBP組。各枸杞多糖保護(hù)組于紫外線(xiàn)照射前2h加入不同濃度的LBP,正常對(duì)照組和UVA模型組只加入相同量的培養(yǎng)基。紫外線(xiàn)照射前吸取培養(yǎng)基,用D-hanks液清洗2次,并鋪上一薄層D-hanks液,在紫外燈下照射,以2支平行UVA燈管作為UVA光源,距離臺(tái)面15cm,輻射強(qiáng)度為1mW/cm2,照射時(shí)間為2400s,總劑量為2.4J/cm2。照射完畢后,把原來(lái)吸掉的培養(yǎng)基重新加入各培養(yǎng)皿中,繼續(xù)培養(yǎng)18h,取上清液一式3份,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)其中LDH漏出量。1.3多樣性比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS11.5軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組數(shù)據(jù)以x±s表示,多樣本均數(shù)間比較采用One-wayANOVA檢驗(yàn),組間的兩兩比較采用SNK檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)分析采用秩相關(guān)分析。2結(jié)果2.1組患者a值比較對(duì)照組、UVA+0.1mg/mlLBP組、UVA+0.2mg/mlLBP組、UVA+0.4mg/mlLBP組、UVA+0.8mg/mlLBP組、UVA模型組的A值分別為0.2785±0.0308、0.2248±0.0266、0.2295±0.0144、0.2620±0.0269、0.2730±0.0102、0.2278±0.0186。UVA模型組A值低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說(shuō)明損傷模型制作成功。UVA+0.4mg/mlLBP組和UVA+0.8mg/mlLBP組A值高于UVA模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。UVA+0.1mg/mlLBP組和UVA+0.2mg/mlLBP組A值低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且隨著LBP劑量的增加,A值呈升高趨勢(shì)(r=0.658,P<0.01)。2.2mda含量、ldh漏出量表1可見(jiàn),與對(duì)照組比較,UVA模型組細(xì)胞內(nèi)SOD活力降低,MDA含量升高,LDH漏出量升高;UVA+0.1mg/mlLBP組、UVA+0.2mg/mlLBP組、UVA+0.4mg/mlLBP組MDA含量、LDH漏出量均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著LBP劑量的增加,細(xì)胞內(nèi)SOD活力呈升高趨勢(shì)(r=0.655,P<0.01),MDA含量呈降低趨勢(shì)(r=-0.807,P<0.01),LDH漏出量呈降低趨勢(shì)(r=-0.949,P<0.01)。3uva對(duì)細(xì)胞增殖活力和抗氧化損傷作用陽(yáng)光紫外線(xiàn)中所含的UVA則具有很強(qiáng)的穿透作用(大約1mm),這種作用不僅對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞有影響,更為嚴(yán)重的是,它還可影響位于真皮層的成纖維細(xì)胞,影響皮膚膠原合成,進(jìn)而引起皮膚光老化。紫外線(xiàn)防護(hù)劑是一類(lèi)能夠清除紫外輻射所產(chǎn)生的活性氧的物質(zhì),能夠保護(hù)皮膚對(duì)抗紫外線(xiàn)的氧化損傷,延緩皮膚衰老。本研究選擇茄科植物寧夏枸杞為保護(hù)劑,在體外成功制作紫外線(xiàn)損傷模型,觀(guān)察枸杞多糖對(duì)紫外輻射致體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖、氧化損傷、細(xì)胞膜損傷的保護(hù)作用。活細(xì)胞(特別是增殖的細(xì)胞)能量代謝旺盛,線(xiàn)粒體能量代謝過(guò)程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原為藍(lán)色的結(jié)晶,沉積在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周?chē)?形成的結(jié)晶量與增殖的細(xì)胞數(shù)成正比。DMSO可溶解結(jié)晶,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定其A值,可間接反映細(xì)胞增殖活力,在一定范圍內(nèi),結(jié)晶的形成量與活細(xì)胞數(shù)呈正比。本次實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)LBP對(duì)UVA輻射細(xì)胞活力的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),UVA模型組A值低于對(duì)照組(P<0.01),而除了UVA+0.1mg/mLBP組A值低于UVA模型組外,其余各枸杞多糖保護(hù)組A值均明顯高于UVA模型組。提示UVA可以造成體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活力降低,而枸杞多糖可以劑量依賴(lài)性地增加細(xì)胞的增殖活力。SOD可催化超氧陰離子(O2·)歧化為H2O2和O2,是活力最強(qiáng)的自由基清除劑之一,可以為細(xì)胞提供一道免受自由基損傷的保護(hù)屏障。同時(shí),由于生物膜具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu),自由基攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸而造成脂質(zhì)過(guò)氧化,進(jìn)而對(duì)膜產(chǎn)生強(qiáng)烈的破壞作用,并產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,如醛基(丙二醛)、酮基、羥基等。根據(jù)產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的量,可間接判斷脂質(zhì)過(guò)氧化程度。測(cè)定MDA含量及SOD活力可間接反映機(jī)體抗氧化損傷和清除自由基的能力。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),UVA模型組SOD活力低于對(duì)照組,而MDA含量高于正常對(duì)照組,表明紫外線(xiàn)可以造成成纖維細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化。而各枸杞多糖保護(hù)組可以劑量依賴(lài)性地增加SOD活力,降低MDA含量,表明枸杞多糖具有對(duì)抗UVA對(duì)成纖維細(xì)胞的氧化損傷作用。LDH屬于細(xì)胞內(nèi)酶,當(dāng)細(xì)胞受到外來(lái)刺激或致傷因素影響后,可大量釋放或漏出LDH到細(xì)胞外,提示細(xì)胞膜受損。因此,測(cè)定LDH漏出量可作為細(xì)胞損傷的標(biāo)志,細(xì)胞外L