牛妊娠相關(guān)糖蛋白elisa法在早期妊娠診斷中的應(yīng)用

牛妊娠相關(guān)糖蛋白elisa法在早期妊娠診斷中的應(yīng)用

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過檢測(cè)奶牛和血液中牛血液中糖蛋白（pag）濃度的變化，可以進(jìn)行牛的早期育種和診斷。哺乳動(dòng)物妊娠時(shí),外周血液中PAG變化可作為母牛是否懷孕的標(biāo)志。在母牛懷孕時(shí),PAG濃度從妊娠后第15～35d開始上升,但因血清中不同PAG水平的差異,到妊娠第26～30d才能將PAG作為可靠的妊娠指標(biāo)。目前,商業(yè)化檢測(cè)PAG對(duì)待檢牛影響小,結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)化,適用于規(guī)模牛場(chǎng)母牛早期妊娠診斷。為了分析利用牛妊娠相關(guān)糖蛋白檢測(cè)奶牛早期妊娠診斷的實(shí)際效果,于2012年6～8月對(duì)寧夏平吉堡奶牛場(chǎng)273頭配種后28～45d的荷斯坦奶牛使用基于PAG的商品化試劑盒(IDEXX牛懷孕檢測(cè)試劑盒)進(jìn)行早期孕檢,并在人工授精后75d進(jìn)行直腸妊娠診斷確認(rèn),分析快速PAG酶聯(lián)免疫法的實(shí)際應(yīng)用效果,以期提高奶牛繁殖效率,并為奶牛場(chǎng)進(jìn)行母牛的早期妊娠診斷提供借鑒。1材料和方法1.1試驗(yàn)動(dòng)物選擇發(fā)情配種后28～45d的黑白花奶牛273頭,采集靜脈血液10mL,送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速PAG酶聯(lián)免疫法妊娠診斷。1.2試劑牛懷孕檢測(cè)試劑盒由北京愛德士元亨生物科技有限公司提供。批次41169-X961,有效期至2013年2月28日。1.3妊娠合并心臟病模型將待檢血清和牛懷孕檢測(cè)試劑盒恢復(fù)到室溫,按照ELISA試劑盒產(chǎn)品說明書要求進(jìn)行孵育和操作,檢測(cè)待檢牛的妊娠狀況,具體結(jié)果詮釋方法為:血清或EDTA血漿S-N值<0.300,為陰性,表示母?？諔?血清或EDTA血漿S-N值≥0.300,為陽性,表示母牛懷孕。1.4矛盾的完成牛懷孕檢測(cè)試劑盒診斷出的陰性(空懷)牛和陽性(懷孕)牛均不予處理,等待配種后75d進(jìn)行直腸妊娠診斷確認(rèn)。自然返情時(shí)直腸觸診有卵泡發(fā)育以及75d直腸觸診未懷孕者確定為空懷牛;75d直腸妊娠檢查懷孕的母牛確定為懷孕牛。1.5空懷牛樣品的pag檢測(cè)結(jié)果在結(jié)果判定中,敏感性為妊娠牛樣品中PAG酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果為陽性的比例;特異性為空懷牛樣品中PAG檢測(cè)結(jié)果為陰性的比例。結(jié)果的陽性預(yù)測(cè)值為PAG檢測(cè)為已孕的牛確定為真實(shí)妊娠的比例,結(jié)果的陰性預(yù)測(cè)值為PAG檢測(cè)為空懷的牛確定為真實(shí)為空懷的比例;結(jié)果的準(zhǔn)確性為PAG檢測(cè)的妊娠狀況(妊娠+空懷)與直腸觸診結(jié)果一致的比例。1.6比較性試驗(yàn)結(jié)果利用Kappa值對(duì)PAG酶聯(lián)免疫法和直腸觸診妊娠診斷結(jié)果進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)。Kappa值為1表明完全符合,0為完全不符。在比較性試驗(yàn)中,Kappa值在0.4～0.5之間,說明符合率中等;0.5～0.6說明符合率良好;>0.6說明符合率很高。2pagelisa試劑盒的準(zhǔn)確性和安全性分析在試驗(yàn)期間,對(duì)273頭奶牛分別使用牛妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG)ELISA試劑盒和直腸檢查兩種方法進(jìn)行妊娠檢測(cè),并將得到的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。利用PAGELISA試劑盒共檢測(cè)出80頭奶牛陰性(空懷),193頭奶牛陽性(懷孕)。在75d直腸檢查時(shí)發(fā)現(xiàn),使用PAGELISA試劑盒檢測(cè)為陰性(空懷)的80頭牛全部為空懷。因此,使用牛妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG)ELISA試劑盒檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值為100%(見表1)。PAGELISA試劑盒檢測(cè)為陽性(懷孕)的193頭牛中,75d直腸檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)其中的167頭已孕,而26頭為空懷,有返情表現(xiàn)的牛平均返情時(shí)間為49.5d,懷疑這26頭牛早期胚胎死亡或者流產(chǎn)。為了分析PAGELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確性,建立了2×2列聯(lián)表(見表2),并在表3中列出了以75d進(jìn)行直腸觸診為標(biāo)準(zhǔn),PAGELISA試劑盒的準(zhǔn)確性。從表3可以得出,PAGELISA試劑盒妊娠診斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確性分別為100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%,Kappa為79.1%。PAGELSIA試劑盒和直腸觸診妊娠診斷結(jié)果符合率很高。Kappa(K)值適用于計(jì)數(shù)資料的一致性評(píng)測(cè),由表2數(shù)據(jù)計(jì)算得來。Kappa值范圍在+1與-1之間。若Kappa值>0.6,表示一致性相當(dāng)可靠。本研究結(jié)果表明:兩種妊檢方法的一致率Po=a+d/N=(167+80)/273=90.5%機(jī)遇一致率Pe=[(a+c)(a+b)/N+(b+d)(c+d)/N]/N=[(167×193)/273+(106×80)/273]/273=54.6%非機(jī)遇一致率=1-Pe=1-54.6%=45.4%實(shí)際一致率=Po?Pe=90.5%?54.6%=35.9%Kappa=Po?Pe1?Pe=35.945.4=0.791實(shí)際一致率=Ρo-Ρe=90.5%-54.6%=35.9%Κappa=Ρo-Ρe1-Ρe=35.945.4=0.791從以上Kappa值可以看出,兩種妊娠鑒別方法結(jié)果的一致有多大程度由非機(jī)遇所帶來,也即真正一致的程度。本試驗(yàn)中Kappa為79.1%,表明PAGELSIA試劑盒和直腸觸診兩種妊娠診斷結(jié)果符合率很高,應(yīng)用PAGELSIA試劑盒完全能夠用于奶牛早期妊娠診斷。3pagelisa試驗(yàn)劑盒檢測(cè)結(jié)果IDEXX牛懷孕檢測(cè)試劑盒是根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理設(shè)計(jì)的、用于檢測(cè)懷孕早期存在于牛血清或EDTA血漿中的懷孕相關(guān)蛋白(PAGs),此類蛋白可以作為牛懷孕的標(biāo)志。微孔板已經(jīng)包被有懷孕相關(guān)蛋白抗體,將待檢樣品進(jìn)行稀釋并孵育后,捕獲到的懷孕相關(guān)蛋白(PAG)可以與特異性的PAG抗體(檢測(cè)溶液)和辣根過氧化物酶標(biāo)記物(酶標(biāo)抗體)結(jié)合。未被結(jié)合的酶標(biāo)抗體則被洗掉,隨后在孔內(nèi)加入TMB底物溶液。孔內(nèi)溶液的顏色深淺與樣品中PAG的含量成比例。最終結(jié)果通過酶標(biāo)儀讀取并利用Xchek軟件進(jìn)行陰陽性判讀。在本研究中,PAGELISA試劑盒檢測(cè)母牛妊娠診斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確性分別為100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%,與直腸檢查75d結(jié)果相同,表明該方法可用于母牛的早期妊娠診斷。Silva等評(píng)估PAG判斷妊娠狀況準(zhǔn)確性試驗(yàn)中得出,PAG檢測(cè)方法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確性分別為96.8%～98.9%、91.7%～97.3%、89.7%～93.8%、97.5%～99.5%和93.9%～97.8%,本研究與Silva等的研究一致,說明PAGELISA試劑盒檢測(cè)的敏感性和陰性預(yù)測(cè)值均很高,便于準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)空懷牛,及時(shí)對(duì)其進(jìn)行處理,及早再次配種,縮短配種間隔,達(dá)到減少空懷天數(shù)的目的。在本研究中,PAGELISA試劑盒檢測(cè)的特異性和陽性預(yù)測(cè)值分別為75.5%和86.5%,兩種方法的差異性可能因?yàn)樵u(píng)估時(shí)間不統(tǒng)一。Silva等的研究對(duì)試驗(yàn)牛只采集血液進(jìn)行PAG檢測(cè)后,立即應(yīng)用B超進(jìn)行妊娠診斷,所以兩種診斷方法符合度很高。在本試驗(yàn)中,PAGELISA試劑盒在母牛配種后28d診斷妊娠狀況,而該奶牛場(chǎng)直腸檢查法在母牛妊娠75d時(shí)具有較高的準(zhǔn)確性,因此選取了75d直腸檢查的方法來評(píng)價(jià)PAGELISA試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確性。在母牛早期妊娠診斷時(shí),由于PAGELISA試劑盒檢測(cè)法和直腸檢查法兩種孕檢方法無法同時(shí)進(jìn)行(間隔47d),因而無法對(duì)其特異性(直腸檢查空懷樣品中,PAGELISA試劑盒法檢測(cè)結(jié)果為陰性的比例)和陽性預(yù)測(cè)值(PAGELISA試劑盒檢測(cè)為已孕的牛只,確定為真實(shí)妊娠)進(jìn)行客觀評(píng)價(jià),因?yàn)镻AGELISA試劑盒檢測(cè)至直腸檢查期間出現(xiàn)的胚胎死亡現(xiàn)象會(huì)干擾特異性和陽性預(yù)測(cè)值的評(píng)估。另外,本試驗(yàn)牛場(chǎng)牛奶尿素偏高,尿素氮升高,也會(huì)造成奶牛子宮中尿素氮的沉積過量,從而導(dǎo)致奶牛的胚胎死亡。本次試驗(yàn)結(jié)果未出現(xiàn)假陽性(PAG檢測(cè)陰性,直腸觸診為妊娠),這對(duì)牧場(chǎng)繁殖管理至關(guān)重要,使用PAGELISA試劑盒不會(huì)將已孕牛只診斷為空懷,而致使繁育人員錯(cuò)誤的為已妊娠牛只進(jìn)行發(fā)情處理,造成已妊娠奶牛的流產(chǎn)。4pagelisa試劑盒法的準(zhǔn)確性和局限性早期妊娠診斷是通過及早發(fā)現(xiàn)空懷牛,并對(duì)其進(jìn)行再處理和再次輸精的方式,直接縮短產(chǎn)犢間隔。目前常用的直腸觸診法通常是在配種后60～90d進(jìn)行,與28d使用牛妊娠相關(guān)糖蛋白診斷相比,對(duì)于一些發(fā)情表現(xiàn)不明顯或者無發(fā)情表現(xiàn)的空懷牛就失去了14d甚至更多及早處理的時(shí)間。牛懷孕檢測(cè)試劑盒具有快速、準(zhǔn)確、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn),適用于規(guī)?；翀?chǎng)的日常繁殖工作