牛性別控制技術(shù)研究現(xiàn)狀及其利用

牛性別控制技術(shù)研究現(xiàn)狀及其利用

動(dòng)物性別控制是指在動(dòng)物出生之前通過人工干預(yù)或控制性別，改變動(dòng)物后代的自然生育比例，并根據(jù)人類意愿開展特定性別的家禽生產(chǎn)。在正常的畜牧生產(chǎn)中有許多重要經(jīng)濟(jì)性狀都與性別密切相關(guān),所以性別控制技術(shù)在畜牧生產(chǎn)上具有重要的意義,因而也吸引了許多科研工作者一直為實(shí)現(xiàn)家畜性別的人工控制而進(jìn)行不懈的努力。對(duì)于畜禽飼養(yǎng)者來說,都希望優(yōu)化商品畜群,讓特定性別的家畜發(fā)揮自己的優(yōu)勢(shì),生產(chǎn)出市場(chǎng)上所需的畜產(chǎn)品。奶牛場(chǎng)主都希望母牛多產(chǎn)雌性犢牛來提高產(chǎn)奶量;在肉牛場(chǎng)中因?yàn)楣ＩL(zhǎng)速度要快于母牛,而且閹公牛肉的市場(chǎng)價(jià)格較高,為提高產(chǎn)肉量必須增加公牛的比例,以上這些都可以通過性別控制來完成。近幾年來,隨著分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及其他相關(guān)學(xué)科的發(fā)展,家畜的性別控制已發(fā)展至分子水平。本文就牛的性別控制技術(shù)研究現(xiàn)狀及其利用情況進(jìn)行綜述。1牛場(chǎng):三種不同的繁育方式從1902年McClung提出性別決定理論之后,對(duì)于性別決定有了劃時(shí)代的突破,1990年英國(guó)學(xué)者Sinclair和Gubby發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物(包括人類)Y染色體短臂上靠近常染色體區(qū)的35K區(qū)域存在的性別決定區(qū)(SRY)。同時(shí)伴隨著人工授精和胚胎移植技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,性別控制的研究出現(xiàn)了高潮。當(dāng)前牛的繁育方式主要有3種:一是有規(guī)模的牛場(chǎng)或地區(qū)多采用人工授精的方式;二是一些現(xiàn)代化的飼養(yǎng)水平較高的牛場(chǎng)采用胚胎移植的方式;三是在我國(guó)個(gè)別畜牧業(yè)不太發(fā)達(dá)的地區(qū)仍然保持自然交配的方式。與此相對(duì)應(yīng)的性別控制技術(shù)也有3種不同的途徑:一是在人工授精前通過對(duì)X與Y精子分離以控制性別:二是在胚胎移植前對(duì)胚胎的性別進(jìn)行鑒定以控制性別;三是通過控制外環(huán)境來控制性別。飼養(yǎng)者可以根據(jù)自己實(shí)際情況,選擇合適的性別控制技術(shù)加以實(shí)施,以提高經(jīng)濟(jì)效益。1.1x與y精子分離牛染色體的數(shù)目為60條,其中58條為常染色體,另外兩條為性染色體,即X、Y染色體,一般認(rèn)為雄性動(dòng)物胚胎的性染色體為XY型,雌性動(dòng)物胚胎為XX型。至于Y染色體,只在公牛才含有,因此,精卵結(jié)合時(shí)精子的類別就決定了牛的性別。X與Y精子之間存在著微弱的生物學(xué)差異,關(guān)于這方面國(guó)內(nèi)外科技工作者進(jìn)行了多方面研究。如X、Y精子在體積、密度、電荷、運(yùn)動(dòng)性和DNA含量、表面抗原等方面存在差異,從而為分離精子提供了依據(jù)。實(shí)施X和Y精子的分離再通過人工授精可以有效地達(dá)到性別控制的目的。1.2牛肉中的性染色體在胚胎移植時(shí),對(duì)移植前胚胎進(jìn)行性別鑒定,人為地選擇某一性別的胚胎移植給受體,可以達(dá)到性別控制的目的。牛的兩條性染色體的形態(tài)與常染色體不一樣,其鑒別相對(duì)容易。雄性胚胎的性染色體為XY型,雌性胚胎的性染色體則為XX型。利用特異性探針檢測(cè)法,可鑒別出胚胎的性別,再進(jìn)行移植。1.3精子在果酒精神病理中所處環(huán)境的差異是所產(chǎn)生性別主要是由遺傳決定的,即由性染色體與常染色體的對(duì)比關(guān)系決定。在自然交配的情況下。精子在母牛生殖道運(yùn)行和受精過程中,所處環(huán)境的差異將對(duì)母牛所產(chǎn)犢牛的性別產(chǎn)生一定影響。此外,性別決定機(jī)制中性染色體理論并非這個(gè)機(jī)制的全部,外界環(huán)境中的某些因素也可能不同程度地影響胚胎性別的發(fā)育,從而改變性率比。2牛性別控制的方法和現(xiàn)狀2.1x和y精的分離根據(jù)精子的特征,目前已設(shè)計(jì)出了許多分離精子的方法。2.1.1沉降介質(zhì)的選擇X精子的體積較大,DNA含量也比Y精子多3%～4%,故沉淀較快。王亞鳴等利用卵黃、甘氨酸、甘油和乳糖配制比重為1.03～1.04的培養(yǎng)分離液作為沉降介質(zhì),分離的精子產(chǎn)雌犢率61%。沉降法是以比重的不同為基礎(chǔ)的,X精子與Y精子的比重雖然有所不同,但差異較小,且比重會(huì)隨精子的成熟情況不同而有所變化,所以沉降法的效果不是十分理想。2.1.2精子電泳法精子膜電荷的大小取決于與核蛋白結(jié)合的唾液酸的含量,X與Y精子膜電荷的分布有差異。Shroedom在1932年最早報(bào)道了利用電泳法來分離牛的精子,即在一定的酸堿度下,對(duì)精液進(jìn)行電泳。由于Y精子尾部膜電荷量較高,而X精子頭部膜電荷較高,當(dāng)以中性緩沖液電泳時(shí),向陽(yáng)極運(yùn)動(dòng)的多為X精子,游向陰極的多為Y精子。因此,根據(jù)精子表面帶電荷量不同,通過電泳可以將X與Y精子分離,這種方法一般能獲得較高的母犢率。2.1.3x、y精子分離由于X精子密度1.1141g/cm3,而Y精子密度1.1134g/cm3,所以可根據(jù)二者在密度上的差異來離心分離。密度梯度法利用蔗糖、乳糖作為介質(zhì)來對(duì)精子高速離心,結(jié)果上層多為帶F小體的Y精子,下層為不帶F小體的X精子,分離后X、Y精子的純度可達(dá)73%～94%。但是密度梯度法較繁瑣,而且分離后的X、Y精子比例為55.1:41.1,這一數(shù)值雖在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異,但在生產(chǎn)實(shí)踐上并無實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。2.1.3精子的分離和利用應(yīng)用免疫學(xué)方法分離精子是從發(fā)現(xiàn)H—Y抗原后逐漸發(fā)展起來的。在組織器官移植實(shí)驗(yàn)中,雌性排斥來自基因型相同的雄性的移植體,這表明雄性存在某種特異的細(xì)胞表面抗原,被命名為雄性特異性弱組織相容性Y抗原,簡(jiǎn)稱H-Y抗原。現(xiàn)已證明H—Y抗原被保留在整個(gè)進(jìn)化過程中,除了某些過渡品種外,在所有異型配子的性別品種的體細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)H—Y抗原存在,Zaborski(1979)報(bào)道:只有Y精子才能表達(dá)H—Y抗原。因而,利用H—Y抗體檢測(cè)精子質(zhì)膜上存在的H—Y抗原,再通過一定的分離程序,就能將精子分離成為H—Y+(Y精子)和H—Y-(X精子)兩類。將所需性別的精子進(jìn)行人工授精,即可獲得預(yù)期性別的后代。譚禮(1985)在骨移植研究中,發(fā)現(xiàn)同種或異種個(gè)體骨移植成功的公牛血清能凝集部分精子,而一般公牛犢血清對(duì)精子不發(fā)生凝集現(xiàn)象。賈福德通過對(duì)天津市牛育種站提供的種公牛精液應(yīng)用生殖免疫方法制作性別化的凍精來對(duì)牛進(jìn)行人工授精,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)母犢率可達(dá)60.70%,比自然性比例提高10.70個(gè)百分點(diǎn)。目前,H—Y+、H—Y-精子分離的主要方法有:免疫親和柱層析法、直接分離法及免疫磁力法。免疫法分離精子的效率較高,但經(jīng)處理后的精子數(shù)目少而且活力低,因此很難在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。2.1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式細(xì)胞儀是進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)等研究的重要工具,它由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、分選系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成,能夠定量測(cè)定精子等多種單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜、胞漿以及核內(nèi)的多種物質(zhì),而且具有測(cè)定快速、精確、多參數(shù)的特點(diǎn)。自20世紀(jì)70年代以來,它在臨床診斷方面的應(yīng)用越來越廣泛。近幾年來,美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究中心繁殖實(shí)驗(yàn)室在前期使用流式細(xì)胞儀及分選系統(tǒng)進(jìn)行家畜精子分離的基礎(chǔ)上,成功的完成了應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)通過其它精子技術(shù)所獲得的定性精液進(jìn)行再次檢測(cè)的研究。李慧斌等(2000)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了牛精液的分離效果,發(fā)現(xiàn)未分離原精中X和Y精子的比例以及產(chǎn)犢的性別比例基本均為1:1,而利用富含X精子的定性精液在230頭實(shí)驗(yàn)后代中得到的雌雄性別比例高達(dá)1.64:1,利用富含Y精子的定性精液在145頭后代中的雌雄比例為0.75:1。流式細(xì)胞法是當(dāng)前分離X、Y精子較準(zhǔn)確的方法,它的理論基礎(chǔ)是:X精子的DNA含量比Y精子的高。對(duì)于牛,X精子比Y精子DNA含量高3.80%,且染料著色量與精子DNA含量成正比。因此,X精子吸收的染料就多,X精子發(fā)出的熒光較強(qiáng)。具體的做法是:先用DNA特異性染料對(duì)精子進(jìn)行活體染色,然后精子連同少量稀釋液逐個(gè)通過激光束,探測(cè)器根據(jù)精子的發(fā)光強(qiáng)度把電信號(hào)傳遞給計(jì)算機(jī),計(jì)算機(jī)指令液滴充電使發(fā)光強(qiáng)度高的液滴帶正電,弱的帶負(fù)電,即X精子帶上正電荷,Y精子帶上負(fù)電荷。當(dāng)經(jīng)過高壓電場(chǎng)時(shí)會(huì)向不同方向偏轉(zhuǎn),達(dá)到分離的目的。用分離后的精子進(jìn)行人工授精或體外受精對(duì)受精卵和后代的性別進(jìn)行控制。此法具有重復(fù)性、科學(xué)性和有效性的特點(diǎn),分離準(zhǔn)確率高達(dá)90%,但是分離速度太慢,會(huì)影響精子的活力導(dǎo)致受胎率降低,故此法有待改進(jìn)。2.2pcr和性別控制技術(shù)在進(jìn)行性別鑒定中的應(yīng)用由于X、Y精子間的差異不顯著,使得直接分離精子困難重重。目前,較理想的家畜性別控制的途徑是直接進(jìn)行胚胎的性別鑒定,現(xiàn)在胚胎移植技術(shù)已大量地應(yīng)用畜牧生產(chǎn)特別是牛生產(chǎn),根據(jù)需要達(dá)到選擇并移植某一性別的胚胎使之發(fā)育也可產(chǎn)生所需性別的后代。截至2004年3月25日,在中國(guó)工程院院士旭日干教授領(lǐng)導(dǎo)下,我國(guó)研究人員將國(guó)外的良種肉牛試管冷凍胚胎通過PCR性別控制技術(shù)進(jìn)行性別鑒定,然后將已確定性別的胚胎移植給受體母牛,5頭經(jīng)性別控制的試管牛犢在內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心順利誕生,其性別鑒定的準(zhǔn)確率高達(dá)100%。這是我國(guó)首次利用試管牛冷凍胚胎進(jìn)行性別控制取得的成果。2.2.1牛的胚胎移植前鑒定此法即通過核型分析來完成牛的胚胎性別鑒定。動(dòng)物胚胎的核型是固定的(XX或XY),有XX染色體的為雌性,有XY染色體的為雄性,這種方法鑒定胚胎性別的準(zhǔn)確率幾乎為100%,但操作過程較繁瑣,操作的時(shí)間長(zhǎng),獲得高質(zhì)量的中期染色體分裂較難,對(duì)胚胎損壞大。牛的胚胎在移植前可用簡(jiǎn)單的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)來鑒定牛的性別。這一技術(shù)已經(jīng)在鼠和綿羊中實(shí)驗(yàn)成功。在牛胚胎滋養(yǎng)層上取一小部分細(xì)胞,經(jīng)Colcemid(乙酰甲基秋水仙堿)培養(yǎng)基培養(yǎng),使有絲分裂停留在中期,通過滲透壓使細(xì)胞膨脹破裂。釋放出染色體并加以固定、染色,檢查性染色體,根據(jù)染色體在細(xì)胞分裂中期的不同譜帶和Y染色體的大小、形態(tài)來判斷性別。此外,近期又逐漸興起了胚胎分割后進(jìn)行性別鑒定再移植的方法。其具體做法:對(duì)2～8細(xì)胞胚胎進(jìn)行顯微操作,用顯微操作儀上的玻璃針(或)9片),將每個(gè)卵裂球分離成半胚進(jìn)行切割;或是將桑葚胚或囊胚一分為二或一分為四,并把每塊細(xì)胞團(tuán)放入空的透明帶內(nèi),對(duì)其中一塊進(jìn)行性別鑒定,之后再進(jìn)行移植,最終達(dá)到性別控制的目的,其準(zhǔn)確率高達(dá)100%。2.2.2酶法近些年來由于分子生物學(xué)的研究得到不斷深入地開展,同時(shí)也取得了巨大成就,對(duì)于牛的胚胎移植目前也相繼出現(xiàn)了幾種分子水平的檢測(cè)方法。2.2.2.pcr和探針檢測(cè)y染色體存此項(xiàng)技術(shù)是上世紀(jì)80年代逐漸發(fā)展起來的一種方法。該法需首先從雄性的Y染色體上提取一DNA片段,然后用放射性同位素標(biāo)記作為DNA探針。同時(shí)先提取被檢胚胎的DNA的同源序列,用PCR擴(kuò)增后與探針進(jìn)行雜交,并根據(jù)斑點(diǎn)的顯示來判斷是否有Y染色體的存在。雜交為陽(yáng)性的是雄性胚胎,雜交是陰性的為雌性胚胎。此法對(duì)胚胎進(jìn)行檢測(cè)的準(zhǔn)確率高達(dá)95%。2.2.2.cr擴(kuò)增法crSRY基因的發(fā)現(xiàn),為胚胎性別鑒定提供了可靠的途徑,同時(shí)也使PCR技術(shù)應(yīng)用于胚胎性別鑒定成為可能。無論是XY型胚胎,還是XX型胚胎,只要它們的染色體具有SRY基因,那么胚胎就為雄性。PCR擴(kuò)增法是一種模仿體內(nèi)DNA復(fù)制的過程,它主要是針對(duì)牛SRY的DNA序列設(shè)計(jì)特異引物,并通過PCR擴(kuò)增胚胎SRY特異DNA序列來鑒定胚胎的性別,電泳后出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的SRY為陽(yáng)性,則判斷為雄性胚胎,而無擴(kuò)增條帶的SRY為陰性,則為雌性胚胎。歐陽(yáng)紅生等(1995)用PCR技術(shù)對(duì)牛胚胎性別進(jìn)行鑒定,準(zhǔn)確率達(dá)到100%;王京紅等對(duì)已知性別的牛的DNA樣品進(jìn)行性別鑒定,并與真實(shí)性別作比較,發(fā)現(xiàn)結(jié)果極為相似。該法因有可靠的操作程序,具有高效、快速的特點(diǎn),近年來得到迅速的發(fā)展。但其最大問題就是污染,因而在操作上要嚴(yán)格操作程序,避免外源DNA片段的污染。2.2.3擴(kuò)大細(xì)胞dna的pcr和熒光把握從培養(yǎng)了7d的胚胎中,取10%～20%的細(xì)胞放人含聚乙烯吡咯烷酮的PBS液中。細(xì)胞分解后,用PCR擴(kuò)增其DNA,并在紫外光下觀察。雄性胚胎的細(xì)胞樣品發(fā)出粉紅色的熒光。檢查過的胚胎就可植入母體。Jakma在73枚胚胎中,有39枚為雄性,性別診斷的精確率為92.30%。2.3外來環(huán)境差異在對(duì)母牛進(jìn)行人工授精或自然交配時(shí),精子在母牛生殖道中運(yùn)行至輸卵管與卵子結(jié)合完成受精過程,在此過程中所處的環(huán)境差異對(duì)母牛將來產(chǎn)出的牛犢性別比例產(chǎn)生影響。同時(shí),母牛妊娠期間所處的外界環(huán)境也對(duì)其胚胎性別的發(fā)育產(chǎn)生一定影響,并最終改變了后代的性別比例。所以,可以通過控制外界環(huán)境而達(dá)到性別控制的目的。2.3.1豐富或喂堿飼料時(shí)酵母的情況通常在飼料飼喂量不足或飼喂酸性飼料類型時(shí),母牛多產(chǎn)雄性后代;當(dāng)飼喂量豐富或飼喂堿性飼料時(shí),母牛多產(chǎn)雌性后代。在年齡結(jié)構(gòu)上,年老型的母牛常常多產(chǎn)雄性后代,中年型的母牛多生雌性后代,而對(duì)于雙親都為中年牛來說,則多產(chǎn)雌性犢牛。2.3.2抗氧化性因素Y精子對(duì)酸性環(huán)境的耐受力要弱于X精子,而對(duì)堿性環(huán)境的耐受力要強(qiáng)于X精子。因而當(dāng)所用凍精的解凍液或母牛生殖道的pH值低于6.8時(shí),Y精子的活力減弱,運(yùn)動(dòng)緩慢,所以失去了與卵子結(jié)合的較多機(jī)會(huì),最終導(dǎo)致后代雄性牛犢數(shù)少;而當(dāng)pH值大于7.0時(shí),Y精子的活力增強(qiáng),活動(dòng)迅速,有較多的與卵子結(jié)合的機(jī)會(huì)。因而后代雄性牛犢多。黑木常青用5%賴氨酸注入牛子宮頸內(nèi),引起產(chǎn)母率提高,之后我國(guó)的李秀山、胡春山、王瑞山、王念功等將賴氨酸用生理鹽水稀釋成中濃度,輸精前30min向雌性陰道內(nèi)注入溶液1毫升,取得了產(chǎn)母率55%～72%的結(jié)果,證明賴氨酸有使生殖道黏液變酸的趨勢(shì),而且酸性環(huán)境有利于受精卵合成XX合子,從而提高產(chǎn)母犢率。另外,用激素處理精液,也可調(diào)節(jié)動(dòng)物生殖道黏液pH值。弗拉季爾斯卡婭在精液稀釋中加入雄性激素,使豬后代雄性達(dá)64%～70%;當(dāng)加入雌性激素,后代有60%的雌性個(gè)體。2.3.3在牛人工授精方面排卵前一定時(shí)間輸精多產(chǎn)雌犢,而在排卵后輸精多產(chǎn)雄犢?？刂剖诰珪r(shí)間的方法較簡(jiǎn)便,但對(duì)掌握適時(shí)輸精的技術(shù)要求較高。此外,在牛人工授精技術(shù)上,為保證凍精的受胎率,一般推薦在母牛接近排卵時(shí)授精。這樣和牛性別控制的目的相矛盾,所以要想既保證理想人工授精受胎率,又保證較高生母犢率的適宜授精時(shí)間就需要做更多的研究。齊信義研制出“適時(shí)授精性別控制儀”