液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析啤酒酵母甘露聚糖乙酰解產(chǎn)物

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析啤酒酵母甘露聚糖乙酰解產(chǎn)物

除了作為生命能量和結(jié)構(gòu)成分的碳?xì)浠衔锖突衔锿猓細(xì)浠衔锖突衔镆彩侵匾畔⒎肿?。一切重要的生命活?dòng)過程(包括受精、胚胎發(fā)育、細(xì)胞癌變、病毒感染、細(xì)菌感染以及植物生長調(diào)節(jié)等)都有糖鏈的參與。糖的結(jié)構(gòu)同其功能有密切的關(guān)系,要了解糖的功能首先必須對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。經(jīng)典的化學(xué)方法(如高碘酸氧化、Smith降解)和核磁共振技術(shù)等對于解析糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)很有用,但這些方法需要一定數(shù)量和高純度的樣品,并且結(jié)果的分析不但需要豐富的經(jīng)驗(yàn),而且往往很困難。近10年來,隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展,液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)越來越多地被用于寡糖的結(jié)構(gòu)測定和研究之中。其主要方式有快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)、液態(tài)二次離子質(zhì)譜(LSI-MS)、熱噴霧質(zhì)譜(TSP-MS)、電噴霧質(zhì)譜(ESP-MS)、離子噴霧質(zhì)譜(ISP-MS)以及多級質(zhì)譜(MSn)等。由于液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)僅需要微量的樣品,并且短時(shí)間內(nèi)就能給出寡糖的結(jié)構(gòu)和相對分子質(zhì)量信息,因此該技術(shù)目前已成為糖化學(xué)研究者首選的方法之一。甘露聚糖是啤酒酵母細(xì)胞壁的主要成分之一,它具有多種生物活性,如抗腫瘤、抗輻射、抗感染等。一般甘露聚糖通過共價(jià)鍵的形式同蛋白質(zhì)連在一起,因此又稱之為甘露聚糖蛋白。其相對分子質(zhì)量為20000~200000,主鏈為單鏈,其糖苷鍵形式為α-1,6連接;主鏈甘露糖殘基上連有豐富的支鏈,其糖苷鍵形式為α-1,2或α-1,3連接。對于酵母甘露聚糖來說,選擇性乙酰解反應(yīng)可以特異性地切斷主鏈的α-1,6-糖苷鍵,其切斷α-1,6-糖苷鍵的速度比切斷支鏈的α-1,2-糖苷鍵、α-1,3-糖苷鍵的速度快。選用合適的反應(yīng)條件,即控制反應(yīng)的酸度、溫度和時(shí)間可以使甘露聚糖鏈完全從α-1,6-糖苷鍵連接的骨架處斷開,生成若干種寡糖側(cè)鏈。前人在分析甘露聚糖乙酰解產(chǎn)物時(shí)曾采用Bio-P-2,SephadexG-15等柱色譜方法來分離各種寡糖側(cè)鏈,再根據(jù)所繪制的洗脫曲線確定寡糖支鏈的組成。本文則采用目前先進(jìn)的液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù),對甘露聚糖乙酰解產(chǎn)物進(jìn)行分離和檢測,取得了比較滿意的結(jié)果。1材料和方法1.1合成硫酸鈉、濃硫酸、甲醇鈉、三氯甲烷、甲苯、鹽酸PlatformLCZ4000液-質(zhì)聯(lián)用儀,Waters公司生產(chǎn)。無水吡啶、醋酸酐、碳酸氫鈉、無水硫酸鈉、濃硫酸、無水甲醇、甲醇鈉、三氯甲烷、甲苯、鹽酸均為國產(chǎn)分析純。乙腈為色譜純。1.2分析條件1.2.1流動(dòng)相及流速相色譜柱:μBondapackNH2,孔徑為12.5nm,粒度為10μm,3.9mmi.d.×300mm;柱溫:30℃;流動(dòng)相:乙腈-水(70∶30,體積比)溶液;流速:1mL/min;進(jìn)樣量:10μL。1.2.2第一錐孔電路電噴霧電離(ESI);正離子模式[M+Na]+;毛細(xì)管電壓:3.5kV;脫溶溫度:280℃;源溫:120℃;離子能量:0.5eV;倍增器電壓:650V;第一錐孔電壓:45V;第二錐孔電壓:5V;氮?dú)饬髁?3.6L/h。1.3甘草聚糖乙酰解的制備甘露聚糖選擇性乙酰解:稱取經(jīng)SepharoseCL-6B純化的甘露聚糖50mg,置于50mL圓底燒瓶中,加入5mL吡啶及5mL乙酸酐,密封,烘箱中加熱,于100℃下保持24h。用氮?dú)饬鞔抵翝鉂{狀,加入甲苯,混勻,再吹干。反復(fù)多次,直至把吡啶完全驅(qū)趕掉。再加入5mL冰醋酸和0.5mL濃硫酸,輕輕搖勻,使固形物完全溶解。將該燒瓶置于40℃水浴中,保溫12h。再加入10mL吡啶,終止乙酰解反應(yīng),用氮?dú)饬鞔蹈?加入5mL三氯甲烷和3mL水,振蕩搖勻,移入離心管。離心(3000r/min×5min),吸去上層水。依次用5mL水、3mL1mol/L鹽酸、3mL1mol/LNaHCO3和水洗滌三氯甲烷層。用無水Na2SO4除去三氯甲烷層的水分,濾液用氮?dú)獯蹈伞Ｃ撘阴?在上述濾液的氮?dú)獯蹈蓸又屑尤?mL無水甲醇和1mL0.5mol/L甲醇鈉溶液,搖勻,室溫下放置30min。用氮?dú)饬鞔蹈?即為甘露聚糖乙酰解產(chǎn)物。稱取甘露聚糖乙酰解產(chǎn)物2mg,用5mL流動(dòng)相溶解,經(jīng)有機(jī)膜過濾,濾液即可用于液-質(zhì)聯(lián)用分析。2結(jié)果與討論2.1不同菌株的自轉(zhuǎn)糖質(zhì)量數(shù)和相對分子質(zhì)量圖1為甘露寡糖選擇離子色譜圖。由圖1可知,甘露聚糖乙酰解產(chǎn)物由5個(gè)組分組成。這5個(gè)組分的選擇離子質(zhì)譜結(jié)果見圖2。Na+的質(zhì)量數(shù)為23,甘露糖的相對分子質(zhì)量為180,甘露糖帶上一個(gè)Na+后,其質(zhì)量數(shù)為203。因此,1號峰代表甘露糖。同理可推知:2號峰代表甘露二糖,3號峰代表甘露三糖,4號峰代表甘露四糖,5號峰代表甘露五糖。由于選擇性乙酰解得到的寡糖實(shí)際上包含一個(gè)主鏈上的甘露糖殘基,因此,可推斷甘露聚糖側(cè)鏈分別由甘露單糖、甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖組成,并且側(cè)鏈的長度以一個(gè)甘露糖基、兩個(gè)甘露糖基為主,其次是3個(gè)甘露糖基,4個(gè)甘露糖基只占很小部分。2.2esi接口方式的優(yōu)點(diǎn)低聚糖聚合度及其相對分子質(zhì)量是解析糖鏈結(jié)構(gòu)所必需的。FAB-MS和LSI-MS可以測定完整寡糖的相對分子質(zhì)量,但需對樣品進(jìn)行衍生化處理;各碎片離子的質(zhì)譜圖比較復(fù)雜,不利于未知物的鑒定。LC-MS采用ESI接口方式具有很大的優(yōu)點(diǎn)。ESI是一種非常軟的電離方式,可以很方便地用于強(qiáng)極性、難揮發(fā)性化合物的離子化,是用質(zhì)譜進(jìn)行大分子化合物相對分子質(zhì)量測定的一個(gè)重大突破。通常的電離方式如EI法,根本無法得到糖的分子離子峰,ESI電離方式的出現(xiàn)使這一問題迎刃而解。本研究表明:利用LC-MS,采用選擇離子方法可以快速、直接地給出待測樣品各糖組分的相對分子質(zhì)量,這要比其他方法簡單并準(zhǔn)確得多。另外,ESI方式下樣品用量極少,不易污染離子源,靈敏度高,它的檢測限可達(dá)10-15g~10-12g。特別是采用選擇離子方法,可以很好地排除非糖分子離子的干擾,使圖譜的解析變得簡單而直觀。3成為甘草寡糖混合