牛體外受精技術的研究進展

牛體外受精技術的研究進展

動物繁殖技術是生物技術的一個重要分支。繁殖技術從20世紀50年代人工授精技術到20世紀70年代胚胎移植技術的應用，似乎才真正開始動物繁殖技術的新紀元。牛的繁殖技術在過去的50年里取得了顯著進展，這是一個以人工授精起始的連續(xù)過程。隨著體外受精、精子分離和核移植（克?。┑燃夹g的發(fā)展，這些連續(xù)性的繁殖技術將是目前和未來提高生產力的強有力手段。1其他方面的研究自1982年以來，家畜體外受精技術，尤其是牛體外受精(IVF)技術的發(fā)展十分迅速，僅僅10年時間，就已從理論上、方法上得到充分的完善和發(fā)展，成為動物胚胎工程及細胞工程領域內的一個基本和重要的研究分支，并從20世紀80年代末就開始進入應用階段。牛IVF技術的主要環(huán)節(jié)包括：(1)屠宰牛卵巢卵母細胞的采集、保存和運輸。(2)卵巢卵母細胞的采集：利用注射器吸取或其他方法，將未成熟的卵母細胞從可見卵泡中取出，然后在顯微鏡下選擇卵丘細胞層完整的正常卵母細胞進行體外成熟培養(yǎng)。(3)卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)(IVM)：將處于生發(fā)泡期的未成熟卵在添加激素或血清的培養(yǎng)基內培養(yǎng)至成熟階段，進行體外受精。(4)精子的體外獲能處理：體外條件下利用化學藥物(IA、咖啡因及肝素等)使精子達到獲能狀態(tài)。(5)受精處理：把培養(yǎng)成熟的卵子和獲能處理好的精子放在一起培養(yǎng)，使其在體外條件下完成受精過程。(6)受精卵的體外發(fā)育培養(yǎng)(IVC)：通過一系列培養(yǎng)條件的探索，使受精卵發(fā)育到桑椹胚和囊胚階段。(7)發(fā)育胚胎的冷凍保存。(8)胚胎的質量評定。(9)胚胎移植：這是體外受精技術的最終目的。(10)受體牛的妊娠診斷和管理。由于牛IVF技術在養(yǎng)牛業(yè)上的巨大應用潛力，世界上許多發(fā)達國家均投入大量的人力和財力進行了牛IVF胚的開發(fā)性研究，從而促使牛IVF技術從實驗研究開始走向商品化應用。目前世界上在這項技術上投入力量最大的有日本、美國、英國，中國和丹麥也做了大量工作。在20世紀90年代中葉，美國、加拿大和歐洲（主要是德國、意大利、法國和荷蘭）就出現了IVF商業(yè)化應用的實驗室。幾年后，在南美洲（如巴西和阿根廷）和大洋州（如澳大利亞和新西蘭）也建立了這樣的實驗室。采用超聲波掃描經陰道活體采集卵母細胞技術（OPU）的應用加速了IVF在活體家畜上的應用。目前，對供體牛采卵有2種方法：其一是對供體牛不做任何處理，每周采卵1次；其二是對供體牛進行激素處理，使之有更多的中、小卵泡出現后再進行采卵。經激素處理供體牛的效果明顯優(yōu)于不處理。IVF商業(yè)化應用的最初目的是從母畜體內獲得成活的胚胎而不使用傳統(tǒng)技術來受孕。目前，IVF是胚胎移植（ET）程序的一部分。它主要應用于那些發(fā)情處理較為困難、不能生產可移植胚胎的母畜或者是在繁殖期間出現異常的母畜（如卵巢粘連或輸卵管阻塞）。IVF也應用于由于年齡、突發(fā)狀況、疾病等造成的繁殖障礙的母畜，以及在妊娠期前3個月內的懷孕小母?；虺赡昴概?。IVF還應用于正常繁殖周期的小母牛和成年母牛以及發(fā)情期前的犢牛。商業(yè)性機構和研究機構已將OPU-IVF技術應用于不同類型的母畜（包括初情期前的犢牛、小母牛、成年母牛），不同年齡的母畜（包括初情期前、初情期后和適齡母牛），不同品種，不同繁殖周期（間期、妊娠期和分娩后），不同采卵頻率（1周1次、1周2次、1個月2次），不同激素處理（FSH,nBST）和不同的IVF過程（BRL細胞共培養(yǎng)，化學限定培養(yǎng)液，血清），并獲得不同程度的成功。IVF技術可提高精子使用效率。在精子細胞內注射（ICSI）技術未廣泛應用于牛IVF商業(yè)化生產之前，IVF技術就為使用相對少量精子生產成活胚胎提供了條件。這使精子利用率更高，并為精子性別分離提供重要條件。從1992年到2000年，使用的胚胎培養(yǎng)液從TCM-199培養(yǎng)液到與BRL細胞共培養(yǎng)的MenezoB2培養(yǎng)液，其中加入10%胎牛血清（FCS）來培養(yǎng)胚胎。從2001年開始，培養(yǎng)系統(tǒng)改為SOF的檸檬酸鹽半限制性培養(yǎng)液（添加5%FCS）從而避免或減少出現犢牛體型過大綜合征的危險。在SOF系統(tǒng)中培養(yǎng)的第6.5d才觀察培養(yǎng)皿內胚胎的發(fā)育狀況，培養(yǎng)箱內的條件是5%的O2、6%的CO2、和89%的N2，并保持較高濕度。由于胚胎體外冷凍的不良效果，通常采用鮮胚進行移植?？赡苁怯捎谂囵B(yǎng)條件或受精程序造成胚胎對外界條件較為敏感。IVF技術的應用效果受很多因素的影響，其中主要因素是供體的狀態(tài)，卵母細胞的質量和將胚胎從合子培養(yǎng)到囊胚期的技術。盡管IVF技術從應用到動物育種上開始至今，這項技術已有較大發(fā)展，但仍有許多改進之處，包括提高卵母細胞和胚胎的活性，減少培養(yǎng)系統(tǒng)對犢牛出生大小的影響，提高卵母細胞的質量，成功使用性別分離后的精子，ICSI技術以及腔前卵泡的培養(yǎng)，這些方面將是最近及未來研究的主要方向。2體外法性別鑒定與性別分離肉牛生產者和牛產業(yè)中一直都對性別預測給予廣泛關注。精子性別分離處理后可以通過生產期望性別的個體從而增加奶牛和肉牛業(yè)的效益，并能充分滿足市場和商業(yè)化生產的需要。最典型的例子是生產奶牛的母犢以及肉牛生產中所需的公犢。對于牛育種者和精子人工授精公司，可應用這項技術在小范圍母牛群內選育出優(yōu)秀公牛。精子性別鑒定常采用DNA含量的方法；胚胎性別鑒定方法包括活體檢查與PCR、免疫熒光法等；對胎兒性別鑒定常采用妊娠60～90d超聲波檢查的方法。應用這項技術時大多得到滿意的結果，準確性較高。并且可根據既定目標提前對性別進行分離（精子性別或胚胎性別），而不必等到胎兒時期進行性別分離。在美國，胚胎性別鑒定大規(guī)模商業(yè)性過程中使用的唯一方法是活體檢查胚胎后用PCR擴增Y染色體上特定DNA，這種方法對90%以上的胚胎有效，準確率達95%。盡管如此，應用PCR對胚胎進行性別鑒定時，所有的胚胎必須活體檢查后測定，并且大約50%的非期望性別的胚胎被廢棄，其效率也不高。胎兒的性別鑒定通常在妊娠期55～90d進行，為了改變性別比例必須終止不需要的妊娠，這種改變性別比例的方法也較煩瑣和昂貴。最初的商業(yè)化胚胎性別鑒定程序是美國TransOraGenetics公司的AB技術法，這個程序需要5min進行活體檢查，PCR過程需2h，一些胚胎需使用Y-擴增產物。目前，一家公司（XY,Inc,FortCollins,Colorado,America）已擁有成功分離X、Y精子的技術，其原理是根據X和Y精子中DNA含量的不同。在牛和馬上，X精子中的DNA含量比Y精子多4%。采用高速流式細胞分離儀可在幾分鐘內分離6百萬個X或Y精子，純度達90%。精子性別分離后可應用于AI、ET和IVF程序。目前報道的結果表明小母牛采用冷凍的性別分離后的精子進行AI后，在子宮體內沉積的精子低劑量（1～1.5×106個精子）和高劑量（3×106個精子）兩組的妊娠率（大約50%）相似。阿根廷科學家也得到相似的結果。采用冷凍的性別分離的精子IVF后，胚胎發(fā)育率達18%～26%。但由于超排處理的供體肉牛和奶牛很難將AI的精子運送到輸卵管受精部位，這阻礙了冷凍的性別分離精子在胚胎移植商業(yè)化中的廣泛應用。美國TransOraGenetics公司目前獲得的卵巢來自荷斯坦牛，卵母細胞回收后用X精子進行授精，得到的胚胎移植到奶牛體內。最終可獲得較高的妊娠率，穩(wěn)定的育種性能。在結合體外受精技術的同時，性別控制技術將在養(yǎng)牛業(yè)中產生不可估量的影響。3克隆技術在克氏原螯蝦群體復制中的應用前景展望克隆是用來描述體細胞核移植過程的簡稱，是目前應用的一項輔助繁殖技術。Spreeman(1938）定義胚胎細胞核移植技術是指將一個多細胞胚胎的卵裂球或細胞核通過顯微手術和細胞融合的方法，移植到1個去核的卵母細胞或去核的受精卵中，構成新胚胎（克隆胚胎），然后移植給受體，獲得與核供體胚胎基因型相同的后代（克隆動物）的生物技術。Wilut等（1997）獲得了成年綿羊乳腺上皮細胞核的克隆后代，這一突破性成果為成年哺乳動物的完整復制打下了基礎。經濟效益和遺傳改良并不是克隆的唯一目的。牛的克隆可以用來展覽，保種等，目前，對特定基因型的克隆引起很多實驗室的關注。未來，克隆技術將在肉牛和奶牛商業(yè)化生產中起關鍵作用，克隆可加速由核移植帶來的遺傳改良的普及。胚胎克隆將對奶牛生產產生較大沖擊。我們使用優(yōu)秀胚胎作為核源進行移植，而不必對母牛進行人工授精。作為克隆的核源，其遺傳性狀要好于商業(yè)化種群的平均性狀，克隆加速了非雜交遺傳效益的廣泛開發(fā)。在商業(yè)化農場中使用克隆技術生產克隆動物減少了后備牛群中母牛的百分比。盡管核移植的平均效率已經有很大提高，但其變異仍較大。影響核移植效率的變異來源不僅包括基因型，還包括核源的核型，核移植前供體細胞的處理，以及受體卵母細胞的來源。真皮中成纖維細胞是最常用的供體細胞。這些細胞可以從任何性別中獲得并可在標準組織培養(yǎng)液中培養(yǎng)。目前，?？寺〉纳虡I(yè)化應用取決于社會和制度的接