c-myc與基因表達調(diào)控

c-myc與基因表達調(diào)控

1c-myc轉(zhuǎn)換因素的總結(jié)1.1c-同型半胱氨酸氨酸c-mec的結(jié)構(gòu)組成及生物學意義根據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，c-myc基因是20%的人類癌基因。c-myc基因位于人類第8號染色體上,該基因中高度保守的序列包括兩部分,一部分位于編碼c-Myc的羧基端,一部分位于c-Myc的氨基末端。其蛋白質(zhì)的序列主要包括3個結(jié)構(gòu)域:氨基末端、中間區(qū)域、羧基末端。在氨基末端有兩個高度保守的序列,這兩個元件結(jié)構(gòu)稱之為myc盒(mycbox),即myc盒1和myc盒2,分別由70~88和153~163之間的氨基酸殘基序列組成。在c-Myc的羧基端則含有螺旋-環(huán)-螺旋(helixloop-helix,HLH)、亮氨酸拉鏈(leucinezipper,LZ)等結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)與c-Myc的生物學功能之間有著十分密切的聯(lián)系(圖1)。據(jù)估計,通過招募組蛋白乙酰酶、染色質(zhì)調(diào)控蛋白、一些基本轉(zhuǎn)錄因子以及DNA甲基化酶等一系列途徑,c-Myc參與調(diào)控從果蠅到人類等高等生物細胞基因組中15%的基因。1.2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用c-Myc的羧基端包含一個HLH-LZ區(qū),該區(qū)與CAC/TGTG序列(一種稱為E盒的保守核苷酸序列)之間具有特異的結(jié)合作用,并通過結(jié)合該E盒而啟動基因轉(zhuǎn)錄。c-Myc的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于其氨基末端的143個氨基酸殘基區(qū)。與c-Myc一級結(jié)構(gòu)高度同源的Max不含轉(zhuǎn)錄激活區(qū),它是通過自身的HLH-LZ結(jié)構(gòu)域與c-Myc的HLH-LZ結(jié)構(gòu)域作用形成異源二聚體,該二聚體與含有E盒的啟動子相結(jié)合而激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。Max也可與另一種含HLH-LZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)Mad/Mxi1形成異源二聚體并抑制轉(zhuǎn)錄,這樣c-Myc、Max、Mad組成一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡,共同調(diào)節(jié)細胞的增殖分化或凋亡等生物學功能。c-Myc的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用除了通過其直接的轉(zhuǎn)錄激活作用外,還包括由其他蛋白質(zhì)介導的間接轉(zhuǎn)錄調(diào)控。如c-Myc通過作用于TRRAP(transformation/transcriptiondomain-associatedprotein)等以促進組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性,從而促進目的基因的轉(zhuǎn)錄,這樣c-Myc也參與了染色質(zhì)水平上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;c-Myc可招募STAGA(SPT3-TAF9-ADA-GCN5acetyltransferase)復合物以促進轉(zhuǎn)錄活性。但也有研究表明c-Myc家族結(jié)合于其靶點基因時并不必然伴隨著啟動子區(qū)組蛋白的酰基化。除了轉(zhuǎn)錄激活作用外,還發(fā)現(xiàn)了c-Myc對某些基因表達的抑制作用,如一些含有INR起始子序列的基因轉(zhuǎn)錄可被c-Myc所抑制。研究表明,c-Myc并非作為一個直接的轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮抑制效應,而可能是通過結(jié)合TFII-1、YY-1和Miz-1等轉(zhuǎn)錄激活因子,以干擾由后者介導的INR的轉(zhuǎn)錄活性,從而到達轉(zhuǎn)錄抑制的作用。c-Myc的轉(zhuǎn)錄抑制作用還可通過招募組蛋白去乙酰酶復合物來起作用,其中MM1的作用尤為重要,MM1是一種核內(nèi)c-Myc結(jié)合蛋白,可結(jié)合于c-Myc盒2而干擾c-Myc的功能。在一些研究中發(fā)現(xiàn)c-Myc對基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用還需要甲基化酶對該基因啟動子區(qū)進行DNA甲基化。2c-myc的生物學功能2.1cdk1和c-現(xiàn)實的作用機制真核生物的細胞周期是由一系列調(diào)控因子有序結(jié)合和激活來調(diào)節(jié)控制的。其中G1期的調(diào)控在細胞周期的進程中起到了關(guān)鍵點的作用,c-Myc對該關(guān)鍵點的調(diào)控是在多個水平上進行的:一方面,c-Myc直接轉(zhuǎn)錄激活細胞周期蛋白D2和CDK4以形成更多的細胞周期蛋白D2-CDK4復合物,后者通過競爭性結(jié)合一種CDKI,Kip1,使其從細胞周期蛋白E-CDK2復合物中分離出來,產(chǎn)生游離的活性細胞周期蛋白E-CDK2復合物;一方面c-Myc通過其調(diào)節(jié)產(chǎn)物泛素黏酶CUL-1、CKS介導Kip1的降解,以游離出活性的細胞周期蛋白E-CDK2復合物;另一方面c-Myc也通過直接作用于一種蛋白質(zhì)磷酸酶Cdc25以激活CDK2和CDK4,所有這些均促進細胞周期蛋白E-CDK2成為活性自由狀態(tài),并被細胞周期蛋白活性激酶CAK激活,導致E2F從視網(wǎng)膜母細胞瘤易感基因pRb上釋放,最終實現(xiàn)使細胞從G1點進入S期。c-Myc可能對細胞周期蛋白D1的表達進行調(diào)節(jié),在不同的組織和細胞內(nèi),其調(diào)節(jié)的方式是不同的。在MycER(Myc與雌激素受體的融合基因)誘導表達的Rat-1細胞中,細胞周期蛋白D1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達都可以被MycER所誘導表達而上調(diào);但是在組成性表達MYC的BALB/C-3T3成纖維細胞中,細胞周期蛋白D1的mRNA表達被下調(diào);在MycER誘導的NIH3T3細胞中,研究發(fā)現(xiàn)c-Myc并非直接轉(zhuǎn)錄上調(diào)細胞周期蛋白D1,而是通過上調(diào)eIF-4E,后者使細胞周期蛋白D1的mRNA半衰期延長,從而間接上調(diào)其蛋白質(zhì)表達水平。由此可見,c-Myc的調(diào)節(jié)作用是復雜的。用反義核苷酸技術(shù)抑制c-Myc表達后,細胞周期蛋白D1表達下降,p21從細胞周期蛋白D1-CDK復合物解離出來與細胞周期蛋白E-CDK2結(jié)合,并伴隨著細胞周期蛋白E-CDK2活性的下降。c-Myc的過表達會導致細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白E以及細胞周期蛋白D2的表達上升,其中c-Myc是通過直接的轉(zhuǎn)錄激活作用來促進細胞周期蛋白E的表達的。c-Myc可能也參與了CDK1的轉(zhuǎn)錄啟動,CDK4作為c-Myc的直接下游靶點也被證實。c-Myc可以抑制p27和p16的細胞周期阻遏功能;c-Myc也可與Max形成異源二聚體的形式作用于Miz-1、SP1等轉(zhuǎn)錄因子,干擾后者對p15和p17等的轉(zhuǎn)錄作用。另外,Myc-Max異源二聚體可直接促進cdc25的轉(zhuǎn)錄,在淋巴瘤中,c-Myc的過表達與Cdc25A的上調(diào)是高度一致的;但在非小細胞肺癌NSCLC細胞中,Cdc2A和Cdc25B的過表達與c-Myc的過表達無關(guān)。c-Myc可通過與轉(zhuǎn)錄因子CBF/NF/Y形成復合物而共同調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)基因Hsp70的表達;在小鼠中發(fā)現(xiàn)ECA39可被c-Myc調(diào)節(jié),而該基因在酵母中的同源物參與調(diào)節(jié)G1-S期的運行。2.2c-同型半胱氨酸,cd95、tnf、tra分子誘導的凋亡對c-Myc誘導凋亡的研究始于32D.3白血病前體細胞系,該細胞的生長以及細胞中c-Myc的表達都是依賴于IL-3的,在正常生長條件下,c-Myc的過表達對32D.3細胞生長沒有影響;而當IL-3缺失時,過表達c-Myc則會促進細胞的凋亡。在缺少血清的Rat-1成纖維細胞中,過表達c-Myc或是誘導表達MycER均可誘導細胞凋亡,這可能是細胞的一種保護機制:當周圍的環(huán)境允許細胞繼續(xù)增殖生長時,在生長信號的作用下細胞會選擇增殖;當生長刺激信號缺失時,c-Myc的過表達則會導致細胞凋亡。抑制Bin1后并不影響c-Myc介導的增殖和轉(zhuǎn)化,但卻下調(diào)了由c-Myc介導的凋亡作用。這表明c-Myc通過不同的途徑分別調(diào)控凋亡和增殖。有關(guān)c-Myc誘導凋亡的機制研究,因為細胞的種屬和組織差異而各不相同。在一些凋亡信號,如過氧化、DNA損傷、生長因子缺失等信號刺激下,CD95/Fas通過與死亡受體CD95受體的作用使FADD結(jié)合于CD95受體,隨后FADD招募caspase-8前體,后者自剪接活化后啟動凋亡,c-Myc可通過作用于CD95、TNF、TRAIL而促進由該通路所誘導的細胞凋亡。c-Myc也可誘導細胞色素c從線粒體內(nèi)釋放到胞質(zhì)中,這可能是通過激活Bax完成的,當Bax在線粒體內(nèi)被激活后導致線粒體膜結(jié)構(gòu)改變,引起線粒體外膜透性增強(mitochondrialoutermembranepermeabilization,MOMP),從而使細胞色素c釋放,后者與Apaf-1和procaspase-9結(jié)合形成凋亡體,并在ATP存在的條件下最終導致caspase級聯(lián)反應引起凋亡。另外,c-Myc也可以通過ARF間接激活轉(zhuǎn)錄因子p53而調(diào)控凋亡,c-Myc也能抑制NF-κB的活性而使細胞對TNF介導的凋亡敏感,因而促進凋亡。在c-Myc誘導人肝癌Huh7細胞凋亡過程中,c-Fos是重要的介導分子。與c-Myc誘導凋亡相對應的是一些阻遏此途徑的通路和信號分子,抗凋亡信號經(jīng)IGF1受體或是活化的Ras激活AKT激酶,隨后該激酶磷酸化前凋亡蛋白Bad,磷酸化的Bad被胞液內(nèi)的14-3-3蛋白作用失活,從而抑制細胞凋亡;另外,Bcl-2和Bcl-XL等抗凋亡蛋白也可通過抑制細胞色素c的釋放而抑制c-Myc介導的凋亡。2.3e/cdk2表達機制在c-myc-/-的小鼠成纖維細胞中,細胞的增殖率以及總RNA和總蛋白的合成均下降,可見c-myc基因在細胞的生長、增殖中發(fā)揮了重要的作用。在有生長刺激的條件下,細胞中c-myc的mRNA穩(wěn)定性上升,c-Myc的半衰期延長。c-Myc的增殖效應可通過間接活化細胞周期蛋白E/CDK2以促進E2F與DNA的結(jié)合,或通過直接的轉(zhuǎn)錄激活以上調(diào)E2F表達來完成的。總之,c-Myc的某些功能,如增殖,是通過E2F介導的。最近的研究也發(fā)現(xiàn)c-Myc可以通過其下游靶點鐵傳遞蛋白受體(TFRC1)調(diào)節(jié)細胞的增殖。Rb和Ras在細胞的增殖過程中發(fā)揮著重要的作用,c-Myc可通過細胞周期蛋白-CDK復合物磷酸化Rb促進細胞周期進程;同時Ras除可抑制由c-Myc的表達所引起的凋亡外,還可上調(diào)c-Myc的表達,提高其穩(wěn)定性。c-Myc調(diào)控一些細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯因子的表達,翻譯起始因子eIF4E、eIF2α均是c-Myc的直接靶點。RNA聚合酶III(polIII)可合成tRNA和5S核糖體RNA,因此在細胞的蛋白質(zhì)合成和調(diào)節(jié)細胞生長時發(fā)揮作用,c-Myc可通過結(jié)合其特異性的轉(zhuǎn)錄因子TFIIIB而激活polIII的表達。c-Myc的下游基因也包括了某些核糖體蛋白,從而間接的參與了蛋白質(zhì)的代謝調(diào)控。2.4c-現(xiàn)實的作用腫瘤的生長一般是在缺氧的條件下進行的,甲胎蛋白afp基因含有HIF-1的結(jié)合位點,此位點與低氧應激有關(guān),該位點也可被c-Myc結(jié)合,顯示HIF-1和c-Myc可能競爭性調(diào)節(jié)低氧時afp基因的轉(zhuǎn)錄。并且c-Myc的磷酸化是腫瘤細胞在缺氧過程中生長的必要條件。腫瘤細胞在低氧條件下可通過糖酵解產(chǎn)生能量,乳酸脫氫酶LDH-A參與了此代謝過程,LDH-A作為cMyc的應答基因可以被其直接轉(zhuǎn)錄激活,這樣在腫瘤細胞中,c-Myc可以介導LDH-A的過表達,以產(chǎn)生能量維持細胞的生長。除了LDH-A外,c-Myc的過表達還參與調(diào)控了葡萄糖代謝中其他基因的表達。c-Myc參與了DNA合成代謝的調(diào)控,CAD基因產(chǎn)物是一種嘧啶生物合成酶的限速酶,c-Myc可以與Max形成異源二聚體并同高水平RNA聚合酶Ⅱ共同結(jié)合于cad啟動子上,促進CAD基因的轉(zhuǎn)錄。鳥氨酸脫羧酶ODC參與了多胺的合成,多胺在核糖體、DNA、RNA等合成中起著重要的作用,c-Myc通過結(jié)合于其上游的E盒而對其進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。二氫葉酸還原酶(DHFK)基因的啟動子區(qū)也含有E盒結(jié)構(gòu),c-Myc/Max二聚體能結(jié)合其上促進其轉(zhuǎn)錄表達。c-Myc還參與了胸苷激酶TK的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。c-Myc對細胞內(nèi)離子濃度也有調(diào)節(jié)作用,c-Myc可通過抑制H-鐵蛋白、激活離子調(diào)節(jié)蛋白2(IRP2)的表達而提高胞內(nèi)離子濃度;NrampI(natural-resistance-associatedmacrophageprotein1)可以清除胞質(zhì)內(nèi)的離子,c-Myc抑制該蛋白質(zhì)的表達。2.5c-同型半胱氨酸c-mec在正常的細胞中c-Myc的表達是被嚴謹調(diào)控的。在靜止期的細胞中,c-Myc的表達是很微量的,當有生長因子刺激時,c-Myc作為最初的應答基因快速積累,并在整個細胞周期進行中維持較高的含量,直到子細胞進入靜止期才恢復到本底水平。一旦cMyc過表達,就會激活一些保護性的通路,如p19/p14ARF/p53而誘導凋亡從而避免腫瘤形成;但是這些保護性的通路一旦發(fā)生突變等而被破壞,c-Myc的表達亦處于失控狀態(tài),便可能會導致癌變發(fā)生。在一些惡性的、低分化的腫瘤中一般都伴隨著c-Myc的失控表達,c-Myc對于不同的細胞具有不同的惡性轉(zhuǎn)化作用,部分原因是c-myc基因在不同的組織細胞中具有不同的表達活性,并且還與其他類似的癌基因之間有協(xié)同作用有關(guān),如轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(MTA1)、熱刺激蛋白HSP90A等。除了癌癥,c-Myc也與其他的一些疾病有關(guān)。糖尿病是由于β胰島細胞完全或是相對的缺失導致的,在糖尿病中,伴隨著c-Myc表達的增加,產(chǎn)生胰島素的β胰島細胞去分化或是凋亡,其胰島素的分泌也下降,這是因為c-Myc缺乏激活胰島素基因表達的功能,通過與轉(zhuǎn)錄因子NeuroD競爭性的結(jié)合胰島素基因啟動子的E盒結(jié)構(gòu)而抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達?；|(zhì)金屬酶MMP基因在動脈粥樣硬化的發(fā)生和形成中起重要的作用,c-Myc可特異的結(jié)合于其啟動子區(qū)而調(diào)節(jié)該基因的表達,所以c-Myc也參與了動脈粥樣硬化的病理過程。3c-現(xiàn)實的研究c-Myc是一個具有b/HLH/Zip結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,同時具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制作用。c-Myc參與調(diào)控腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移、調(diào)控細胞的代謝、基因組的穩(wěn)定性等,然而這個龐大的調(diào)控信號圖的深入機制仍不是很清楚,通過對c-Myc調(diào)節(jié)基因及下游靶點網(wǎng)絡的研究可以最終揭示c-Myc的功能。c-Myc的應答基因包括可直接被c-Myc結(jié)合的基因或者其表達受c-Myc活力與表達調(diào)節(jié)的基因。由于對c-Myc活力調(diào)控的機制研究較少,目前對c-Myc靶基因的研究主要集中于被c-Myc結(jié)合的基因以及隨c-Myc蛋白變化而表達發(fā)生改變的基因。前者研究的代表方法為染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunopriciptation,ChIP),后者則通過構(gòu)建合適的模型通過芯片或基因表達系列分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)等高通量技術(shù)實現(xiàn)。3.1c-現(xiàn)實的結(jié)合ChIP是一種可直接獲取轉(zhuǎn)錄因子與靶基因特異性結(jié)合的技術(shù):在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復合物,并將其隨機切斷為染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學方法沉淀此復合體,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。使用ChIP技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)c-Myc的結(jié)合位點中11%的位點高度保守,在不同的細胞中均能不依賴于c-Myc的表達水平而被c-Myc結(jié)合。除了標準的E盒,一些非標準的E盒也是c-Myc的結(jié)合位點,并且c-Myc的過表達可以提高其與一些低親和位點的結(jié)合能力,甚至結(jié)合于正常狀態(tài)下的非結(jié)合位點,c-Myc的結(jié)合需要該位點的乙酰化,且c-Myc能增強組蛋白的乙?；?但是位點的乙?；c這些基因的轉(zhuǎn)錄激活無關(guān)或者說c-Myc的結(jié)合并未伴隨該基因表達的改變。這可能是因為在某些位點,c-Myc不能單獨完成轉(zhuǎn)錄調(diào)控,還需要其他蛋白質(zhì)的參與;另外c-Myc的某些作用是未知的,還可能參與了其他的功能——而相應的作用機制并不為我們所知。如有研究發(fā)現(xiàn),c-Myc結(jié)合的一部分基因并非參與編碼而是microRNA。當然這將是一個新的更大的未知領域。同樣基于檢測蛋白-DNA的結(jié)合以確定c-Myc的靶位點的思路,有人將果蠅的dMyc基因與DamDNA甲基化基因融合轉(zhuǎn)染進果蠅,這樣當融合蛋白中的dMyc結(jié)合于其靶點時,DamDNA甲基化酶會將靶結(jié)合位點附近1.5~2.0kb區(qū)域的DNA甲基化,通過檢測與分析這些甲基化的DNA序列,從而獲得dMyc蛋白結(jié)合位點的信息。3.2c-子研究c-現(xiàn)實的作用靶點在研究隨c-Myc變化而發(fā)生表達改變的基因以確定c-Myc的靶基因時,需要構(gòu)建一些合適的模型。在一些早期的研究中,由于c-myc是一個早期應答基因,可以采用血清饑餓和再刺激細胞上調(diào)c-Myc的表達,繼而檢測其應答基因mRNA和蛋白質(zhì)水平的動態(tài)表達情況。但這種模型忽略了c-Myc表達的復雜性,因為其表達受到磷酸化、泛素化等多種翻譯后修飾的調(diào)控。啟動子-報告基因分析也曾被應用于c-Myc靶點的研究,雖然能在一定水平上提示可能的靶點信息,但卻不能反映體內(nèi)活細胞的真實情況。為了在體內(nèi)活細胞的真實狀態(tài)下研究c-Myc的靶點情況,通過外源表達c-Myc基因然后分析其他基因的表達情況不失為一條可行的途徑。有研究者結(jié)合SAGE技術(shù),通過轉(zhuǎn)染Ad-MYC,以鑒定分析c-Myc調(diào)控的作用靶點。與轉(zhuǎn)染Ad-GFP的對照相比,共發(fā)現(xiàn)476個標簽變化顯著,其中216個被上調(diào),260個被下調(diào)。這種方法克服了體外試驗的不真實性,而且盡量減低了其他基因的干擾。在外源表達的基礎上添加可控的誘導成分,這樣誘導型的MycER系統(tǒng)則更為便捷。MycER是Myc基因與雌激素受體(ER)的鑲嵌合體,當它被轉(zhuǎn)染進細胞后,通過雌激素類分子刺激而發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變并被轉(zhuǎn)運到核內(nèi),結(jié)合于c-Myc的靶點從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。由于該系統(tǒng)沒有其他蛋白質(zhì)的合成,降低了背景干擾,在MycER被雌激素分子激活后的應答基因均可看作c-Myc的靶基因,因此是一個有效的體內(nèi)篩選c-Myc靶點的模型。如有研究者使用該模型結(jié)合寡聚核苷酸微陣列技術(shù)對Myc的調(diào)節(jié)基因進行了表達分析,將轉(zhuǎn)染MYCER基因的人原代成纖維細胞經(jīng)誘導表達MYC后收集RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行微陣列雜交分析,發(fā)現(xiàn)有27個基因被上調(diào),9個被下調(diào)。但該方法的缺陷是,用于激活MycER中Myc表達的雌激素類分子也可能介導了雌激素相關(guān)內(nèi)源基因的表達,所以在結(jié)果的分析時,難以排除雌激素配體的背景干擾。以上的模型基于外源性誘導表達c-Myc蛋白以檢測其他基因的表達差異。而對于c-Myc缺陷時細胞基因的表達情況則無法分析。于是有研究者構(gòu)建了一系列細胞突變株,包括c-myc缺失的c-myc–/–細胞株。利用芯片技術(shù)分三組作比較分析:c-myc+/+和cmyc–/–間的比較分析以確定與正常表達的c-Myc相關(guān)的基因,通過慢生長和快速生長狀態(tài)下Myc的誘導