一測多評法測定白芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量

一測多評法測定白芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量

白芍是一種常見的中醫(yī)。根據(jù)《中國藥典》2010年版，牡丹是女性綜合征植物，具有活血、止汗、軟肝止痛、平肝陽、抗高血壓、平肝陽的功效。它的質(zhì)量控制主要基于芍藥的含量。芍藥內(nèi)酯苷也是白芍中的主要活性成分,且含量較高,應(yīng)作為白芍質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。已有文獻(xiàn)報道采用HPLC法測定白芍中芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷的含量,但因缺乏芍藥內(nèi)酯苷對照品供應(yīng),限制了同時對白芍中這兩個主要成分進(jìn)行含量測定在實際工作中的應(yīng)用?！耙粶y多評”法(QAMS)是一種用于多成分質(zhì)量控制的研究思路,目前已用于解決中藥質(zhì)量控制中缺乏對照品這一瓶頸問題,黃連的一測多評標(biāo)準(zhǔn)已被2010年版《中國藥典》采納。超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)是近年來發(fā)展較快的新型液相色譜檢測技術(shù),相對于傳統(tǒng)高效液相色譜(HPLC)具有更好的分離效率、峰容量以及靈敏度,目前正被越來越廣泛地應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系的研究。本研究應(yīng)用“一測多評”法對白芍進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制,即以供應(yīng)量大、價格較低的芍藥苷對照品為內(nèi)標(biāo)物,通過建立其與芍藥內(nèi)酯苷的相對校正因子進(jìn)行含量計算,降低檢測成本和時間,提高方法的實用性。1儀器、檢測方法Watersalliance(e2695SeparationModule,e2998PhotodiodeArrayDetector)高效液相色譜儀,Agilent1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司,包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測器、工作站),WatersAcquityUPLCSystem,ZQ2000quadtruplespectrometry(Waters公司,USA),電子分析天平(MettlerAE200),KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。乙腈、磷酸(色譜純,Merck公司),水為MilliQ超純水(Millipore,Bedford,USA);甲醇、乙醇等其他試劑均為分析純。芍藥內(nèi)酯苷(albiflorin,AF)、芍藥苷(paeoniflorin,PF)對照品均為實驗室自制(HPLC檢測,經(jīng)面積歸一化法計算在高、低質(zhì)量濃度純度均>98%)。本研究收集市售白芍樣品16批,由上海中醫(yī)藥大學(xué)吳立宏副研究員鑒定為毛茛科植物芍藥P.lactiflora的干燥根,標(biāo)本保存在上海中醫(yī)藥大學(xué)。樣品粉碎,過3號篩,抽真空保存。2方法和結(jié)果2.1方法研究2.1.1流動相乙腈-0.2%磷酸溶液55.UltimateTMAQ-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相乙腈-0.02%磷酸溶液(15∶85);檢測波長230nm;流速1.0mL·min-1;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL。結(jié)果見圖1。2.1.2%磷酸法WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱(2.1mm×50mm,1.7μm);流動相乙腈-0.02%磷酸溶液(13∶87);檢測波長230nm;流速0.3mL·min-1;柱溫30℃;進(jìn)樣量2μL。結(jié)果見圖1。2.1.3對照品溶液的制備取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷對照品適量,精密稱定,加甲醇分別制成每1mL各含80,160μg的溶液,即得HPLC對照品溶液;精密吸取HPLC對照品溶液5mL,至20mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得UPLC對照品溶液。2.1.4hplc供試品溶液的制備取本品粉末(3號篩)約0.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇20mL,稱定,超聲處理(240W,45kHz)30min,放冷,80%甲醇補(bǔ)足失重,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得HPLC供試品溶液;精密吸取HPLC供試品溶液5mL,至20mL量瓶中,加80%甲醇至刻度,搖勻,即得UPLC供試品溶液。2.1.5制備工藝的確定取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷對照品適量,精密稱定,甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成含芍藥內(nèi)酯苷1.982g·L-1和芍藥苷0.797g·L-1的對照品貯備溶液。分別精密吸取不同體積的對照品貯備溶液,制成含芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷不同質(zhì)量濃度的系列溶液。按上述色譜條件測定,以對照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行回歸處理,得芍藥內(nèi)酯苷回歸方程分別為Y=1.18×107X-2.36×104(r=0.9999,HPLC),Y=34732X-144.5(r=0.9998,UPLC),線性范圍0.0062~0.3964g·L-1;芍藥苷回歸方程分別為Y=1.30×107X-5.55×104(r=0.9999,HPLC),Y=38308X-262.5(r=0.9997,UPLC),線性范圍0.0100~0.6376g·L-1。2.1.6儀器精密度試驗取同一對照品溶液,在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷在HPLC儀器上的色譜峰面積RSD分別為0.7%,0.1%,在UPLC儀器上的色譜峰面積的RSD分別為1.0%,1.1%,表明儀器精密度良好。2.1.7重復(fù)性試驗結(jié)果取同一白芍樣品粉末6份,精密稱定,按2.1.4項下操作,在上述色譜條件下進(jìn)樣測定,測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.85%,2.3%,RSD分別為1.2%,1.0%,表明方法重復(fù)性良好。2.1.8進(jìn)樣穩(wěn)定性試驗取白芍樣品粉末精密稱定,按2.1.4項下操作,在上述色譜條件下,分別于0,1,8,24,48,72h進(jìn)樣分析,測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷色譜峰面積的RSD分別為0.3%,0.4%,表明樣品溶液在72h內(nèi)穩(wěn)定。2.1.9加樣回收率的測定取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的白芍樣品粉末9份,各約0.1g,精密稱定,分別按已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%,100%,150%3個水平加入芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對照品,按2.1.4項下操作,在上述色譜條件下進(jìn)樣測定,計算加樣回收率,芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷的加樣回收率分別為99.6%,100.1%,RSD分別為2.1%,1.8%。2.2測定相對保留值組型高效液相色譜法本研究考察了WatersallianceHPLC,Agilent1100HPLC,WatersAcquityUPLC液相色譜系統(tǒng),使用UltimateTMAQ-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),AgilentZORBAXC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),Agelavenusil-MPC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),VarianPolarisC18-A色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)和WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱(2.1mm×50mm,1.7μm)5種不同品牌和型號的色譜柱。取混合對照品溶液,注入液相色譜儀,測定,以芍藥苷為內(nèi)標(biāo)物,計算芍藥內(nèi)酯苷的校正因子和相對保留值,結(jié)果見表1。校正因子的平均值為0.940,RSD3.3%。2.3色譜峰的確定本研究采用芍藥內(nèi)酯苷與內(nèi)標(biāo)物芍藥苷的相對保留值和保留時間差2種參數(shù)作為色譜峰定位標(biāo)準(zhǔn),并考察了其在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱上的重復(fù)性。結(jié)果表明相對保留值波動較小,平均值為0.82,RSD2.8%,保留時間差波動較大,因此本研究選用相對保留值作為目標(biāo)色譜峰的定位指標(biāo)比較合適。并且在此色譜條件下各批白芍樣品的色譜峰相對簡單,因此在“一測多評”法的實際應(yīng)用中,可參考藥材典型色譜圖,利用相對保留值定位,根據(jù)內(nèi)標(biāo)物芍藥苷的保留時間,通過相對保留值結(jié)合芍藥內(nèi)酯苷色譜峰的紫外吸收特征,能夠正確判斷目標(biāo)峰的準(zhǔn)確峰位置。2.4加樣測定結(jié)果取16批白芍樣品粉末約0.2g,精密稱定,按2.1.4項下操作,制成供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液進(jìn)樣分析,測定。采用外標(biāo)法和一測多評法計算白芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,兩種方法所得含量值無顯著性差別。說明一測多評法可用于白芍的多成分質(zhì)量評價研究。3測定波長的選擇芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷是白芍中的主要特征性成分,含量較高,藥理活性顯著且與白芍的功能主治相關(guān),是公認(rèn)評價白芍質(zhì)量的適宜指標(biāo)性成分。因芍藥苷對照品價廉易得,故本實驗選用芍藥苷為內(nèi)參物,建立白芍中2個成分的一測多評法。對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷進(jìn)行全波長掃描,其紫外吸收峰相似,均在230nm處有最大吸收,故選擇230nm為檢測波長。為考察不同儀器和色譜柱對校正因子的影響,本研究分別考察了WatersallianceHPLC,Ag