核糖核酸的功能及應(yīng)用

核糖核酸的功能及應(yīng)用

糖核酸（rn）通常存在于動物、植物和微生物細(xì)胞中，這與蛋白質(zhì)的生物合成密切相關(guān)。微生物來源的RNA及其降解產(chǎn)物核苷酸在醫(yī)藥、食品、保健品及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域均有重要的應(yīng)用價值。20世紀(jì)60年代,日本開始研究通過培養(yǎng)富含RNA的酵母來生產(chǎn)RNA,經(jīng)過不斷改進(jìn)培養(yǎng)方法,目前酵母發(fā)酵生產(chǎn)RNA的工藝已相當(dāng)成熟。我國莆田糖廠利用富含RNA的酵母工業(yè)化連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)RNA,菌體RNA含量可達(dá)到菌體干重的14%~15%,年產(chǎn)量達(dá)到200噸。我們主要綜述利用富含RNA的酵母發(fā)酵制備RNA的研究進(jìn)展及其應(yīng)用。1rn的使用1.1輔助保護(hù)大鼠肝損傷模型大鼠的相關(guān)指標(biāo)核酸可作為保健品,能夠有效提高機體的免疫力。動物實驗表明,在日糧中添加酵母核酸,能有效降低嗜水氣單胞菌感染的病死率,同時增加動物的食欲和體重。劉陽等通過肝損傷模型大鼠試驗發(fā)現(xiàn),核酸口服液能降低血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶含量,減輕病變肝臟組織的氣球樣變和胞質(zhì)凝聚,表明核酸對肝損傷模型大鼠有輔助保護(hù)作用。姜桂榮等通過對55例高血脂癥患者的核酸膳食治療,發(fā)現(xiàn)核酸膳食對降低高血壓、高血脂,改善動脈粥樣硬化病效果十分明顯。國內(nèi)外許多核酸保健品已經(jīng)上市。1.2磷酸腺苷atp目前工業(yè)上生產(chǎn)核苷酸的一種可行方案就是以酵母RNA為原料,經(jīng)酶解后分離純化得到4種單核苷酸,再進(jìn)一步酶法合成可得到相應(yīng)的衍生物胞苷二磷酸(CDP)膽堿、S-腺苷甲硫氨酸和尿苷二磷酸(UDP)葡萄糖等。核苷酸是生物體內(nèi)重要的低分子化合物,除作為DNA、RNA的前體,也作為生理、生化過程的調(diào)節(jié)物質(zhì)參與體內(nèi)物質(zhì)代謝。最新研究表明,作為心肌梗死搶救藥物和冠心病預(yù)防用藥的三磷酸腺苷(ATP),能完全中止陣發(fā)性室上性心動過速(PSVT)患者的PSVT癥狀;外源性的ATP還具有抗腫瘤增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能。三磷酸胞苷(CTP)具有激活和促進(jìn)受損傷神經(jīng)組織(包括周圍神經(jīng))再生和修復(fù)的能力,能有效治療突發(fā)性耳聾和糖尿病外周神經(jīng)病。鳥苷酸能賦予食品鮮味,主要與肌苷酸和谷氨酸一起用作增強食品風(fēng)味的食品添加劑。在單核苷酸的基礎(chǔ)上可合成相應(yīng)的衍生物,這些衍生物同樣具有重要的生理功能。尿苷酸經(jīng)UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化合成的UDP-葡萄糖,一方面可作為寡糖、多糖等生物合成的糖的供體;另一方面其單糖結(jié)構(gòu)部分經(jīng)轉(zhuǎn)化或修飾后,成為各類糖類生物合成的中間體。利用固定化細(xì)胞法可催化ATP轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。作為甲基供體和生理性巰基化合物,SAM參與胞內(nèi)許多重要的氧化還原反應(yīng),它不僅控制肝細(xì)胞的生長,還能調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的凋亡,能選擇性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,同時保持正常肝細(xì)胞的生長,在肝癌防治方面具有很高的研究價值?？勺鳛橹委熌X意識障礙和腦昏迷搶救藥物的CDP-膽堿,我國每年需進(jìn)口40噸,而ATP每年需進(jìn)口50噸才能滿足國內(nèi)市場的需要。利用酵母發(fā)酵得到大規(guī)模的RNA原料來生產(chǎn)核苷酸及其衍生物,具有很高的研究價值和廣闊的市場前景。2采用發(fā)酵法制備鈉2.1活性酵母生產(chǎn)rna不同微生物細(xì)胞內(nèi)的RNA含量差異較大(表1),通常在細(xì)菌中RNA含量為5%~25%,在酵母中為2.7%~15%,在霉菌中為0.7%~28%。其中,熱帶假絲酵母RNA的含量較高,一般在8%以上。在一些發(fā)酵液和其他生產(chǎn)廢液、廢渣中通常有一些富含RNA的菌體,如從味精生產(chǎn)廢液中的菌體和啤酒酵母中可提取RNA產(chǎn)品。喬賓福利用芽孢桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)分泌型RNA,該方法能有效簡化RNA提取分離步驟,但尚未見工業(yè)化生產(chǎn)的報道。在啤酒酵母中RNA含量可高達(dá)6%~8%,至今以廢啤酒酵母提取RNA作為生產(chǎn)RNA的有效途徑被廣泛采用,其具有工藝簡單、成本低等優(yōu)點,但收率較低,核酸產(chǎn)品在質(zhì)量和產(chǎn)量上都不能滿足市場的需要。利用培養(yǎng)富含RNA的酵母來生產(chǎn)RNA的工藝,具有如下優(yōu)點:(1)酵母菌體中RNA含量普遍高于其他微生物,且大大高于DNA含量,RNA/DNA達(dá)到29.6;(2)酵母菌體較易收集,且RNA提取容易;(3)能夠得到大量純度高、濁度低的優(yōu)質(zhì)RNA;(4)酵母可以連續(xù)培養(yǎng);(5)酵母培養(yǎng)容易,對培養(yǎng)基的要求極低;(6)提取RNA后的脫核酵母可作為優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料。2.2采用低表面活性劑發(fā)展的突變株RNA含量高的酵母菌多屬于假絲酵母。假絲酵母屬(Candida)是能形成假菌絲、不產(chǎn)生子囊孢子的酵母。不少假絲酵母能利用正烷烴為碳源,其中氧化正烷烴能力較強的假絲酵母多是解脂假絲酵母(C.lipolytica)或熱帶假絲酵母(C.tropicalis)。這些含有高RNA的酵母一般都具有篩選標(biāo)記,或為染料耐受突變株如ATCC20007,或為鉀敏感型突變株,具體的分子機制尚不清楚。Shunichi等篩選了一系列假絲酵母,發(fā)現(xiàn)對鉀敏感型突變株核酸含量均較高,并且以正烷烴作為惟一碳源時,菌體的干重和RNA含量均有明顯提高。李祥鵬等利用亞硝基胍處理熱帶假絲酵母Y-17菌株后得到誘變株RB-40,誘變株利用正烷烴為碳源,在100mL搖瓶中培養(yǎng)時,其RNA含量從5.5%提高到8.8%;再用亞硝基胍處理得到氯化鉀敏感株K7,其RNA含量能達(dá)到11.6%。2.3豐富的鈉發(fā)酵技術(shù)利用富含RNA的酵母發(fā)酵提取RNA,是生產(chǎn)RNA的有效途徑。為得到RNA生產(chǎn)的最佳工藝,須進(jìn)行一系列的篩選與培養(yǎng)工藝優(yōu)化。2.3.1培養(yǎng)基及細(xì)胞的活性根據(jù)酵母菌體生長所需的不同營養(yǎng)成分來選擇合適的培養(yǎng)基組分及配比,對菌體內(nèi)核酸含量的提高具有重要的意義。Shunichi等分別利用甘油、乙醇、豆油、乙酸和正烷烴作為碳源培養(yǎng)假絲酵母,發(fā)現(xiàn)以正烷烴作為惟一碳源時,菌體的干重和RNA含量均有明顯提高。盛建國等分別以原糖液、糖化液和廢糖蜜作為碳源培養(yǎng)熱帶假絲酵母K-79株,發(fā)現(xiàn)以原糖液為碳源時RNA含量最高為8.6%。周震等利用2%的葡萄糖培養(yǎng)熱帶假絲酵母QZN0209株,RNA含量達(dá)到13.9%。氮源的代謝物能夠為菌體生長和RNA積累提供氨基酸和核苷前體,工業(yè)上多用玉米漿和酵母膏作為有機氮源,以尿素或(NH4)2SO4作為無機氮源。磷是微生物進(jìn)行平衡生長的限制因素之一。在無機磷過量存在的情況下,胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的量增加,呼吸速率上升。李祥鵬等在利用6L發(fā)酵罐培養(yǎng)熱帶假絲酵母K-79株時,認(rèn)為培養(yǎng)基中最重要的元素為氮和磷,并且必須有鋅和鐵等微量元素。當(dāng)培養(yǎng)基中加入0.3%的磷酸時,酵母RNA含量能達(dá)到13.9%;而當(dāng)磷酸含量只有0.15%時,酵母RNA含量只有10.8%。通過搖瓶正交試驗,周震等也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中對核酸含量影響最大的是KH2PO4,其次是葡萄糖。酵母細(xì)胞中嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成分別需要谷氨酰胺、天冬氨酸直接參與,實驗證明加入0.3%的谷氨酰胺可使RNA含量提高30%。由于微量元素與酵母的活動密切有關(guān),它們或是酶活性基的成分,或是酶的激活劑,所以在培養(yǎng)基中要加入適當(dāng)濃度的鎂、鋅和鐵等微量元素。2.3.2酵母rna的積累一般來說,菌體生長越快,其個體越大,RNA含量也越高,且其中大部分是核糖體RNA,每個細(xì)胞RNA隨生長速率的變化可達(dá)10倍之多,在快速生長的細(xì)胞中RNA的含量可以達(dá)到細(xì)胞重量的30%。在發(fā)酵過程中,須在對數(shù)生長期終止培養(yǎng),以得到高的核酸含量。酵母發(fā)酵生產(chǎn)RNA為好氧發(fā)酵,溶氧對RNA含量影響較大,酵母在氧氣充足的情況下細(xì)胞分裂增殖迅速,能維持高的生長速率,同時能避免產(chǎn)生對酵母生長不利的乙醇。培養(yǎng)溫度的上升,能使酵母比生長速率增大,RNA含量升高,但同時酵母細(xì)胞加速衰老,自溶也增加,在溫度為32~33℃時對酵母RNA的積累最為有利。李祥鵬等通過培養(yǎng)工藝優(yōu)化,得到了培養(yǎng)熱帶假絲酵母K-79株的最佳條件,即pH值為4.5,培養(yǎng)溫度控制在32~33℃,溶氧不低于20%飽和度,接種量0.5~1.0g(菌體干重)/L,攪拌速度為1000r/min,補料液在4h內(nèi)流加完畢,整個培養(yǎng)過程在6h內(nèi)結(jié)束。在此工藝條件下酵母細(xì)胞濃度達(dá)到20~25g(菌體干重)/L,RNA含量為13%~14%。福建莆田糖廠在此工藝基礎(chǔ)上,采用12m3氣升式發(fā)酵罐、連續(xù)發(fā)酵工藝,發(fā)酵液稀釋率維持在0.66/h左右,菌體干重維持在11~12g/L,RNA含量達(dá)到14%~15%,RNA年產(chǎn)量大約為200噸。2.4破壁方法的提取國內(nèi)關(guān)于從酵母菌體提取RNA的研究較多,多與啤酒酵母的綜合利用相關(guān)。酵母RNA提取主要分3步進(jìn)行:(1)破壁,使核蛋白從細(xì)胞中溶出;(2)除蛋白,使雜蛋白變性沉淀;(3)離心,使核酸與蛋白分離,得到RNA清液,再調(diào)RNA等電點,使RNA粗品沉淀,經(jīng)純化、干燥得到成品。破壁方法有機械破壁、化學(xué)破壁和酶法破壁等多種,現(xiàn)在研究應(yīng)用較多的為化學(xué)破壁法,包括濃鹽法、稀堿法和氨解法等。影響提取效果的主要因素有酵母和化學(xué)試劑的濃度、提取時間和溫度等,其中由于在30~70℃時胞內(nèi)RNA酶活力較強,故要迅速加熱至90℃以上以避免RNA降解。比較濃鹽法和稀堿法提取酵母RNA的工藝,發(fā)現(xiàn)濃