細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)樣本

資料內(nèi)容僅供您學(xué)習(xí)參考，如有不當(dāng)或者侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系改正或者刪除。實(shí)驗(yàn)一葉綠體的分離與熒光觀察1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馊~綠體分離的一般原理和方法,并熟悉應(yīng)用熒光顯微鏡方法觀察葉綠體熒光現(xiàn)象。2．實(shí)驗(yàn)原理葉綠體是植物細(xì)胞中較大的一種細(xì)胞器,能發(fā)生特有的能量轉(zhuǎn)換。利用低速離心機(jī)能夠分離葉綠體,其分離在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液)中進(jìn)行,目的是為了防止?jié)B透壓的改變引起葉綠體的損傷。將勻漿液在1000r/min離心,去除其中的組織殘?jiān)鸵恍┪幢黄扑榈耐暾?xì)胞,然后,3000r/min離心,可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。在室溫下進(jìn)行分離要迅速。某些物質(zhì)在一定短波長(zhǎng)的光(如紫外光)的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài),從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí),就能在極短的時(shí)間內(nèi)放射出比照射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光(如可見(jiàn)光),這種光就稱為熒光。若停止供能,熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后,可直接發(fā)出熒光(稱為自發(fā)熒光),如葉綠素的火紅色熒光。有的生物材料本身不發(fā)熒光,但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光(稱為間接熒光),如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)橘紅色熒光本實(shí)驗(yàn)利用熒光顯微鏡對(duì)發(fā)熒光的葉綠體進(jìn)行觀察。3．實(shí)驗(yàn)材料、用品⑴實(shí)驗(yàn)材料:菠菜葉片⑵實(shí)驗(yàn)藥品:蒸餾水,0.35mol/L氯化鈉溶液,0.01%吖啶橙。⑶實(shí)驗(yàn)儀器:普通離心機(jī),組織搗碎機(jī),天平,熒光顯微鏡,顯微鏡,載玻片,蓋玻片,鑷子,接種針,目鏡測(cè)微尺,物鏡測(cè)微尺,恒溫箱,培養(yǎng)皿,濾紙,試管,試管架,移液管,滴管,燒杯,無(wú)熒光載片,蓋玻片,離心管。4．實(shí)驗(yàn)步驟⑴選取新鮮的菠菜嫩葉,洗擦干后去除葉梗及粗脈,稱3g于0.35mol/L氯化鈉溶液15ml中置組織搗碎機(jī)或研缽中。⑵利用組織搗碎機(jī)低速(5000r/min)勻漿,3~5min,或研磨成勻漿。⑶用6層紗布過(guò)濾,濾液盛于燒杯中。⑷取濾液4ml在1000r/min下離心2min,棄去沉淀。⑸將上清液在3000r/min下離心5min,棄去上清液,沉淀即為葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。⑹沉淀用0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮。⑺取葉綠體懸液1滴置于載玻片上,加蓋玻片后用普通光學(xué)顯微鏡觀察。使用熒光顯微鏡觀察時(shí),將葉綠體懸液滴在無(wú)熒光的載玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙熒光染料,蓋上無(wú)熒光的蓋玻片后即可觀察。⑻觀察葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、測(cè)量1-5個(gè)葉綠體的長(zhǎng)軸和短軸、葉綠體發(fā)射熒光的現(xiàn)象。5．實(shí)驗(yàn)報(bào)告⑴觀察葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu),測(cè)量5~10個(gè)葉綠體的長(zhǎng)軸和短軸求其平均值。⑵記錄熒光顯微鏡下觀察的葉綠體自發(fā)熒光和次生熒光現(xiàn)象,分析結(jié)果。6．思考題⑴分離葉綠體實(shí)驗(yàn)的原理是什么?操作過(guò)程中應(yīng)注意什么?⑵普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡的原理有何異同點(diǎn)?

實(shí)驗(yàn)二線粒體和液泡系的超活染色與觀察活體染色是能使生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織特異性著色但對(duì)活樣品又沒(méi)有毒害作用的一種活體染色方法,其目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu),而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡?；铙w染色技術(shù)可用來(lái)研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。一般把活體染色分為體內(nèi)活體染色與體外活體染色兩類。體外活體染色又稱超活染色,它是由活的動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊,以染料溶液浸染,染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料之因此能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分,主要是靠染料的”電化學(xué)”特性。堿性染料的膠粒表面帶陽(yáng)離子,酸性染料的膠粒表面帶有陰離子,而被染的部分本身也是具有陰離子或陽(yáng)離子,這樣,它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活體染色,理論上應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性或毒性極小的染料,且使用時(shí)需要配成稀淡的溶液。一般說(shuō)來(lái),最為適用的是堿性染料,這可能是因?yàn)樗哂腥芙庠陬愔|(zhì)(如卵磷脂、膽固醇等)的特性,易于被細(xì)胞吸收。詹納斯綠B(JanusgreenB)和中性紅(neutralred)兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料,對(duì)于線粒體和液泡系的染色分別具有專一性。1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康蘑庞^察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布;⑵學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)。2．實(shí)驗(yàn)原理

線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要細(xì)胞器,是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所。細(xì)胞的各項(xiàng)活動(dòng)所需要的能量,主要是經(jīng)過(guò)線粒體呼吸作用來(lái)提供的。活體染色是應(yīng)用無(wú)毒或毒性較小的染色劑真實(shí)地顯示活細(xì)胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而又很少影響細(xì)胞生命活動(dòng)的一種染色方法。詹納斯綠B是線粒體的專一性活體染色劑。線粒體中細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))呈藍(lán)綠色,而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原,成為無(wú)色狀態(tài)。中性紅為弱堿性染料,對(duì)液泡系(即高爾基體)的染色有專一性,只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色,細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色,這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。3．實(shí)驗(yàn)用品⑴器材

顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、解剖盤．載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。⑵試劑①Ringer溶液:氯化鈉0.85g(變溫動(dòng)物用0.65g)氯化鉀0.25g氯化鈣0.03g蒸餾水100ml②10%、1/3000中性紅溶液:

稱取0.5g中性紅溶于50mlRinger液,稍加熱(30-40℃)使之很快溶解,用濾紙過(guò)濾,裝入棕色瓶于暗處保存,否則易氧化沉淀,失去染色能力。臨用前,取已配制的1%中性紅溶液1ml,加入29ml③1%、1/5000詹納斯綠B溶液稱取50mg詹納斯綠B溶于5mlRinger溶液中,稍加微熱(30-40℃),使之溶解,用濾紙過(guò)濾后,即為1%原液。取1%原液lml加入49ml⑶材料人口腔上皮細(xì)胞,洋蔥鱗莖內(nèi)表皮,黃豆(擬南芥)幼根根尖。4．實(shí)驗(yàn)方法4．1人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察⑴清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上。⑵滴2滴1/5000詹納斯綠B染液。⑶用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞。⑷刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中。⑸染色10-l5min(注意不可使染液干燥,必要時(shí)可再加滴染液)。⑹蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察。注意:A、實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自己口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞,將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中,染色10-15min(注意不可染液干燥,必要時(shí)可再加滴染液),蓋上蓋玻片,用吸水紙吸去四周溢了的染液,置顯微鏡下觀察。B、在低倍鏡下,選擇平展的口腔上皮細(xì)胞,換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察。可見(jiàn)扁平狀上皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中,分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu),即是線粒體。4．2洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察⑴用吸管吸取1/5000詹納斯綠B染液,滴1-2滴于干凈的載玻片上,然后,撕取一小片洋蔥鱗莖內(nèi)表皮,置于染液中,染色10-15min.⑵用吸管吸去染液,加一滴Ringer液,注意使內(nèi)表皮組織展平,蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察。⑶在高倍鏡下,可見(jiàn)洋蔥表皮細(xì)胞中央被一大液泡所占據(jù),細(xì)胞核被擠至一側(cè)貼細(xì)胞壁處．仔細(xì)觀察細(xì)胞質(zhì)中線粒體的形態(tài)與分布。4．3植物細(xì)胞液泡系的超活染色與觀察(附加實(shí)驗(yàn))取豆芽的根尖⑴用刀片縱切根尖,放入中性紅染液滴中,染色5-10min。⑵吸去染液,滴一滴Ringer液。⑶蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢(鑷子輕輕地下壓蓋玻片,使根尖壓扁,利于觀察。⑷在高倍鏡下,先觀察根尖部分的生長(zhǎng)點(diǎn)的細(xì)胞,可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡,這是初生的幼小液泡。然后,由生長(zhǎng)點(diǎn)向延長(zhǎng)區(qū)觀察,在一些已分化長(zhǎng)大的細(xì)胞內(nèi),液泡的染色較淺,體積增大,數(shù)目變少。在成熱區(qū)細(xì)胞中,一般只有一個(gè)淡紅色的巨大液泡,占據(jù)細(xì)胞的絕大部分,將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。⑸從以上的觀察結(jié)果,想想標(biāo)題物細(xì)胞液泡系的形態(tài)演進(jìn)情況。5．實(shí)驗(yàn)結(jié)果6．實(shí)驗(yàn)報(bào)告繪口腔上皮細(xì)胞示線粒體的形態(tài)與分布。

實(shí)驗(yàn)三線粒體的分離與觀察1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠貌钏匐x心法分離動(dòng)、植物細(xì)胞線粒體。2．實(shí)驗(yàn)原理線粒體(mitochondria)是真核細(xì)胞特有的,是能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器。細(xì)胞中能源物質(zhì)--脂肪、糖、部分氨基酸在此進(jìn)行最終的氧化,并經(jīng)過(guò)耦聯(lián)磷酸化生成ATP,供給細(xì)胞生理活動(dòng)之需。對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)與功能的研究一般是在離體的線粒體上進(jìn)行的。制備線粒體采用組織勻漿在懸浮介質(zhì)中進(jìn)行差迷離心的方法。在一給定的離心場(chǎng)中(對(duì)于所使用的離心機(jī),就是選用一定的轉(zhuǎn)速),球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時(shí)間內(nèi),組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時(shí)間,就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部,從而分批收集。細(xì)胞器中最先沉淀的是細(xì)胞核,其次是線粒體,其它更輕的細(xì)胞器和大分子可依次再分離。懸浮介質(zhì)一般見(jiàn)緩沖的蔗糖溶液,它比較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相,在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性,在pH7．2的條件下,亞細(xì)胞組分不容易重新聚集,有利于分離。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)注意使樣品保持4℃線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。詹納斯綠B(JanusgreenB)是對(duì)線粒體專一的活細(xì)胞染料,毒性很小,屬于堿性染料,解離后帶正電,由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體的細(xì)胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色,而胞質(zhì)中的染料被還原成無(wú)色。本實(shí)驗(yàn)介紹大鼠肝和玉米線粒體的分離。Ⅰ、大鼠肝線粒體的分離Ⅰ-1.實(shí)驗(yàn)用品㈠材料:大鼠肝臟㈡試劑⑴生理鹽水。⑵1％詹納斯綠B染液,用生理鹽水配制。⑶0．25mol／L蔗糖+0．01mol／LTris-鹽酸緩沖液(pH7．4):0．1mol／L三羥甲基氨基甲烷(Tris)10ml0．1mol／L鹽酸8.4ml加重蒸水到100ml加蔗糖到0．25mol／L。蔗糖為密度梯度離心用D(+)蔗糖⑷0．34mol／L蔗糖+0．01mol／Ltris-鹽酸緩沖液(pH7．4)⑸固定液:甲醇-冰醋酸(9:1)⑹姬姆薩染液:Giemsa粉0.5克,甘油33ml,純甲醇33ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研缽中研磨至無(wú)顆粒,在將剩余甘油倒入混勻,56℃,左右保溫2小時(shí)令其充分溶解,最后加甲醇混勻,成為姬姆薩原液,保存于棕色瓶。用時(shí)吸出少量用1/15mol/L磷酸鹽緩沖液作10-1／15mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6．8):1／15mol／LKH2P0450ml1／15mol／LNa2HP0450ml㈢器材高速離心機(jī)、解剖刀剪、小燒杯、冰浴、漏斗、尼龍織物、玻璃勻漿器。Ⅰ-2.實(shí)驗(yàn)方法⑴制備大鼠肝細(xì)胞勻漿。實(shí)驗(yàn)前大鼠空腹12h,擊頭處死,剖腹取肝,迅速用生理鹽水洗凈血水,用濾紙吸干。稱取肝組織2g,剪碎,用預(yù)冷到0-4℃的0．25mol兒緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后在0-4℃條件下,按每克肝加9ml⑵差速離心。先將9ml0．34mol／L緩沖蔗糖溶液放人離心管,然后沿管壁小心地加入9ml肝勻漿使其覆蓋于上層。用冷凍控溫高速離心機(jī)按圖1順序進(jìn)行差速離心。⑶分離物鑒定。①細(xì)胞核:取細(xì)胞核沉淀一滴涂片,人甲醇-冰醋酸液固定15min,充分吹干,滴姬姆薩染液(原液10-20倍稀釋)染色10min。自來(lái)水沖洗,吹干,鏡檢。結(jié)果:細(xì)胞核紫紅色,上面附著的少量胞質(zhì)為淺藍(lán)色碎片。②線粒體:取線粒體沉淀涂片(注意勿太濃密),不待干即滴加1％詹納斯綠B染液染20min,覆上蓋玻片,鏡檢。線粒體藍(lán)綠色,呈小棒狀或啞鈴狀。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

如果使用不帶冷凍控溫的普通高速離心機(jī)操作,應(yīng)盡量縮短操作時(shí)間、注意樣品的冷凍,保持其生理活性。Ⅰ-3.作業(yè)將線粒體沉淀作一涂片,用姬姆薩染色,檢查是否混雜細(xì)胞核和胞質(zhì)碎片,估計(jì)分離所得線粒體的純度。根據(jù)你的實(shí)際體會(huì),寫出操作注意事項(xiàng)及改進(jìn)方法。Ⅰ-4.思考題1.分離介質(zhì)0．25mol／L及0．34mol/L緩沖蔗糖溶液哪一種在下層?有什么作用?2.分離出的線粒體立即用詹納斯綠B染色和放置室溫2h后再染色,比較二者著色的差異。Ⅱ．玉米線粒體的分離從植物細(xì)胞分離線粒體,除了作線粒體功能測(cè)定外,在植物細(xì)胞遺傳工程中,常見(jiàn)于分離核外基因--線粒體DNA等目的。分離線粒體的方法仍采用均勻介質(zhì)中的差速離心。介質(zhì)中0.25mol／L蔗糖也能夠用0.3mol／L甘露醇代替。EDTA整合二價(jià)陽(yáng)離子,Ca2+除去后細(xì)胞間粘著解體,促使組織分散成單個(gè)細(xì)胞。牛血清白蛋白(BSA)能包在細(xì)胞外面,并作為競(jìng)爭(zhēng)性底物削弱蛋白酶的作用。Ⅱ-1.實(shí)驗(yàn)用品㈠材料玉米黃化幼苗(水稻、高粱等幼苗均可)。㈡試劑⑴分離介質(zhì):0．25mol／L蔗糖,50mmol／l的Tris-鹽酸緩沖液(pH7．4),3mmol／LEDTA,0．75mg／ml牛血清白蛋白(BSA)。50mmol／L的Tris-Hcl緩沖液(pH7．4)配法:50ml0．1mol／L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與42ml0．1mol兒鹽酸混勻后,加水稀釋至100ml。⑵保存液:0．3mol／L甘露醇(pH7．4)。⑶20％次氯酸鈉(NaCl0)溶液。鼠肝勻漿700g×離心10min沉淀上清液沉淀上清液洗滌10ml預(yù)冷的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液2次,每次1000×g離心15min上清液合并10000×g離心10min上清液沉淀(線粒體)洗滌加10ml預(yù)冷的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液2次,每次10000×g離心15min沉淀上清液(純化的線粒體)圖1差速離心順序圖⑷1％詹納斯綠B染液,用生理鹽水配制。㈢器材溫箱、冰箱、紗布、瓷研缽、冷凍控溫高速離心機(jī)Ⅱ-2.實(shí)驗(yàn)方法⑴玉米種子用20％次氯酸鈉溶液浸泡10min消毒,清水沖洗30min,再浸泡清水15h。將種子平鋪在放有濕紗布的盤內(nèi),保持濕度,置溫箱28℃于暗處培肓2-3d。待芽長(zhǎng)到1-2cm長(zhǎng)時(shí)剪下約15g,放0-4⑵加3倍體積分離介質(zhì),在瓷研缽內(nèi)快速研磨成勻漿。⑶用多層紗布過(guò)濾,濾液經(jīng)700×g離心10min。除去核和雜質(zhì)沉淀。⑷取上清液10000×g離心lOmin,沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一次。⑸沉淀為線粒體,可存于0．3mol／L甘露醇中。注意以上勻漿化及離心均控制在0-4Ⅱ-3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果線粒體的觀察:取線粒體沉淀涂在清潔的載玻片上,不待干立即滴加1％詹納斯綠B染色20min,放上蓋玻片,用顯微鏡觀察,線粒體是藍(lán)綠色圓形顆粒。

實(shí)驗(yàn)四水稻懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳钊肓私馑炯?xì)胞在離體條件下的生長(zhǎng)特性,掌握植物細(xì)胞懸浮系的建立以及種細(xì)胞的篩選方法。2．實(shí)驗(yàn)原理利用固體瓊脂培養(yǎng)基對(duì)植物的離體組織進(jìn)行培養(yǎng)的方法在植物遺傳實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。但這種方法在某些方面還存在一些缺點(diǎn),比如在培養(yǎng)過(guò)程中,植物的愈傷組織在生長(zhǎng)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)成分、植物組織產(chǎn)生的代謝物質(zhì)呈現(xiàn)一個(gè)梯度分布,而且瓊脂本身也有一些不明的物質(zhì)成分可能對(duì)培養(yǎng)物產(chǎn)生影響,從而導(dǎo)致植物組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中代謝的改變而利用液體培養(yǎng)基則能夠克服這一缺點(diǎn),當(dāng)植物的組織在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),我們能夠經(jīng)過(guò)薄層震蕩培養(yǎng)或向培養(yǎng)基中通氣用以改進(jìn)培養(yǎng)基中氧氣的供應(yīng)。植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是指將植物細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),在培養(yǎng)過(guò)程中能夠保持良好的分散狀態(tài)。這些小的細(xì)胞聚合體一般來(lái)自植物的愈傷組織。

一般的操作過(guò)程是把未分化的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中不斷進(jìn)行旋轉(zhuǎn)震蕩,一般可用100-12Or/min的速度進(jìn)行。由于液體培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)和震蕩,使得愈傷組織上分裂的細(xì)胞不斷游離下來(lái)。在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物是混雜的,既有游離的單個(gè)細(xì)胞,也有較大的細(xì)胞團(tuán)塊,還有接種物的死細(xì)胞殘?jiān)?/p>

在液體懸浮培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)注意及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞繼代培養(yǎng),因?yàn)楫?dāng)培養(yǎng)物生長(zhǎng)到一定時(shí)期將進(jìn)入分裂的靜止期。對(duì)于多數(shù)懸浮培養(yǎng)物來(lái)說(shuō),細(xì)胞在培養(yǎng)到第18-25d時(shí)達(dá)到最大的密度,此時(shí)應(yīng)進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)。在繼代培養(yǎng)時(shí),應(yīng)將較大的細(xì)胞團(tuán)塊和接種物殘?jiān)?。若從植物器官或組織開(kāi)始建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系,就包括愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、單細(xì)胞分離和懸浮培養(yǎng)。當(dāng)前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的形態(tài)、生理、遺傳、凋亡等研究工作,特別是為基因工程在植物細(xì)胞水平上的操作提供了理想的材料和途徑。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化形成植株,即可獲得攜帶有目標(biāo)基因的個(gè)體。懸浮培養(yǎng)是指將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。⑴起始培養(yǎng)物的建立·選擇適宜的外植體:幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體?！みx擇適宜的培養(yǎng)基:較高濃度激素濃度;必要的附加物質(zhì)。·愈傷組織的要求:松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)⑵懸浮系的建立⑶懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個(gè)優(yōu)點(diǎn):一是增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面,改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng);二是在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害;三是振蕩培養(yǎng)能夠適當(dāng)改進(jìn)氣體的交換。⑷影響懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素·起始愈傷組織的質(zhì)量·接種細(xì)胞密度·培養(yǎng)條件:方式、溫度·繼代周期3．實(shí)驗(yàn)用品超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、恒溫空氣搖床、鑷子、錐形瓶、水稻種子4．實(shí)驗(yàn)方法4.1配制培養(yǎng)基(1)用于誘導(dǎo)水稻愈傷組織的培養(yǎng)基(N6),見(jiàn)表3－1。(2)用于水稻懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基,見(jiàn)表3－2。按照培養(yǎng)基配方取各種藥品,最后用蒸餾水定容到所需體積。所配制的培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用,固體瓊脂培養(yǎng)基分裝在250ml的錐形瓶?jī)?nèi),每瓶約分裝30ml。4.2水稻種子的消毒⑴將種子置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿內(nèi),以體積分?jǐn)?shù)95％的酒精消毒1-2min。⑵取出后用無(wú)菌水沖洗2-3遍。⑶將種子放入25.0g/L的次氯酸鈉溶液中輕輕搖動(dòng)后,浸泡60min。⑷取出后用無(wú)菌水沖洗,將次氯酸鈉溶液充分洗凈。4.3接種在超凈工作臺(tái)內(nèi),將滅菌后的水稻種子接到誘導(dǎo)愈傷組織的固體培養(yǎng)基上,每個(gè)培養(yǎng)瓶接5-10粒種子。接種完畢后用封口膜將培養(yǎng)瓶封好,放在26℃5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個(gè)條件:·懸浮培養(yǎng)物分散性良好,細(xì)胞團(tuán)較小,一般在30-50個(gè)細(xì)胞以下,在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系?！ぞ恍院?細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒,培養(yǎng)基清澈透亮,細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。·細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般2-3天甚至更短時(shí)間便可增加一倍。思考題1.一個(gè)好的懸浮細(xì)胞系有哪些特征?用于建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織有何要求?

2．建立懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)有哪些?

表3－1用于誘導(dǎo)水稻愈傷組織的培養(yǎng)基

表3－2用于水稻懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基配方取各種藥品,最后用蒸餾水定容到所需體積。所配制的培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用,固體瓊脂培養(yǎng)基分裝在250ml的錐形瓶?jī)?nèi),每瓶約分裝30ml。

實(shí)驗(yàn)五聚乙二醇誘導(dǎo)雞血細(xì)胞融合1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康募?xì)胞融合是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并成為一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。在自然情況下,體內(nèi)和體外培養(yǎng)的細(xì)胞均能發(fā)生自發(fā)融合現(xiàn)象。人工方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合開(kāi)始于50年,現(xiàn)在這項(xiàng)技術(shù)已成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫,腫瘤及細(xì)胞工程的重要手段。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn),了解細(xì)胞融合的原理,掌握細(xì)胞融合的基本方法。

2.實(shí)驗(yàn)原理在誘導(dǎo)物(如仙臺(tái)病毒,聚乙二醇)作用下,相互融合的細(xì)胞發(fā)生凝集,隨后在質(zhì)膜接觸處發(fā)生質(zhì)膜成份的一系列變化,主要是某些化學(xué)鍵的斷裂與重排,最后打通兩質(zhì)膜,形成雙核或多核細(xì)胞(此時(shí)稱同核體或異核體)。經(jīng)過(guò)有絲分裂,細(xì)胞核便發(fā)生融合,形成雜種細(xì)胞。

3.實(shí)驗(yàn)用品⑴器具:顯微鏡離心機(jī)天平離心管注射器細(xì)滴管載片、蓋片。⑵試劑:①50%聚乙二醇(PEG):稱取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度試管,在酒精燈火或沸水中加熱溶化。待冷至50℃時(shí),加入等體積并預(yù)熱至50℃的GKN液混勻。②Alsver液:葡萄糖2.05g檸檬酸鈉0.8gNaCl0.42g,加重蒸水至100ml。

GKN液:NaCl8g,KCl0.4g,Na2HPO4.2H2O1.77g,NaH2PO4.2H2O0.69g,葡萄糖2g,酚紅0.01g,溶于1000ml重蒸水中。③0.85%NaCl液⑶材料:一齡公雞靜脈血

4.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法⑴用注射器取2mlAlsver液,再?gòu)囊硐蚂o脈取雞血2ml,注入試管內(nèi),再加6mlAlsver液,混勻后置4℃冰箱中可備作3-4天用。⑵實(shí)驗(yàn)時(shí)取”1”液1ml于離心管中,加入4ml0.85%的NaCl液,混勻平衡后以1200r/min離心5分鐘。⑶去上清液。再重復(fù)”2”兩次,最后一次離心10分鐘。⑷在沉降血球中加入1mlGKN液,混勻使之成為細(xì)胞懸液。(可加GKN液調(diào)節(jié)稀釋使每立方毫米含紅細(xì)胞3-4萬(wàn)個(gè))。⑸在”4”液中加入6-8滴(約0.5ml)50%的PEG液,迅速混勻,常溫下2~3min滴片鏡檢。觀察時(shí)注意不同程度的融合現(xiàn)象。一般分為五個(gè)階段。①兩細(xì)胞膜接觸,粘連;②細(xì)胞膜形成穿孔;③兩細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)連通;④通道擴(kuò)大,兩細(xì)胞連成一體;⑤細(xì)胞完全合并,形成一個(gè)含有兩個(gè)或多個(gè)核的圓形細(xì)胞。⑹計(jì)算融合率:融合率=融合細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)

5.實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.簡(jiǎn)述動(dòng)物細(xì)胞融合的基本過(guò)程。2.選一理想視野,根據(jù)鏡下結(jié)果繪圖,并以圖列式計(jì)算融合率。

實(shí)驗(yàn)六動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)1.目的要求⑴學(xué)習(xí)動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)的一般方法與步驟。學(xué)習(xí)培養(yǎng)細(xì)胞的觀察方法。⑵掌握無(wú)菌操作技術(shù)。2.實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞培養(yǎng)是把生物體內(nèi)的細(xì)胞取出,模擬體內(nèi)生理環(huán)境,在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下,使其生存、生長(zhǎng),繁殖,借以觀察研究細(xì)胞的各種生命現(xiàn)象。細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng),必須滿足兩個(gè)基本要求:一是供給細(xì)胞存活所必須的條件,如適量的水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長(zhǎng)因子、氧氣、適宜的溫度,注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無(wú)菌條件。細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)是指直接從有機(jī)體獲取細(xì)胞立即進(jìn)行培養(yǎng)。任何動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)均需從原代細(xì)胞培養(yǎng)做起。動(dòng)物很多組織的細(xì)胞,如動(dòng)物的腎、肺、卵巢、精巢等組織的細(xì)胞較易培養(yǎng),而神經(jīng)細(xì)胞等較難培養(yǎng)。3.實(shí)驗(yàn)用品⑴材料:孕鼠或新生乳鼠。⑵器材:超凈工作臺(tái),眼科剪,眼科鑷,平養(yǎng)皿,試管,培養(yǎng)方瓶,滴管,橡皮頭,橡皮塞,恒溫箱,倒置顯微鏡。⑶試劑:1640培養(yǎng)基,青霉素溶液100單位／m1,0.25％胰酶溶液,Hank's液,75％酒精。3.實(shí)驗(yàn)方法在操作之前,各種用品需嚴(yán)格消毒,以保證清潔無(wú)菌,超凈工作臺(tái)需紫外線照射20-30分鐘。操作者需用肥皂洗凈手,并用75％酒精擦試。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)酒精燈火焰旁進(jìn)行,以減少污染的可能性。⑴取材:取新生乳鼠一只,浸入75％酒精中浸泡5秒鐘左右,攜入超凈工作臺(tái)內(nèi),置于消毒培養(yǎng)皿中,用Hank's液洗滌2次,再剖開(kāi)胸腹腔,剪取黃豆大小的肺、腎、心、肝、皮膚等組織,分別置于無(wú)菌平皿中。⑵清洗:用含雙抗的Hank's液洗滌二次,并剔除脂肪、血液等。⑶剪切:組織塊移入無(wú)菌短試管或青霉素瓶中,用眼科剪將組織塊剪成lmm3大小的碎塊,再用Hank's液洗滌2次,自然沉淀,棄去帶血的上清液。⑷消化:加入0.25％胰蛋白酶液0.2ml,消化5-10分鐘,吸去消化液,用Hank's液洗一次;再用培養(yǎng)液洗一次。⑸接種:用吸管將組織塊吸入方形培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),均勻分散于底壁上,將此面(有標(biāo)本的面)朝上,加入2-3ml培養(yǎng)液,塞好瓶塞,做好標(biāo)記,置37°C溫箱中培養(yǎng)。⑹培養(yǎng):4-5小時(shí)后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn),使有標(biāo)本的瓶底壁朝下,使培養(yǎng)液浸泡組織塊,繼續(xù)置37°4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果組織塊培養(yǎng)2-3天后開(kāi)始,每天小心取出培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察,一般最先”長(zhǎng)出”的是形態(tài)不規(guī)則的游走細(xì)胞,接著”長(zhǎng)”出成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞,后逐漸出現(xiàn)細(xì)胞分裂,細(xì)胞數(shù)量增多,在組織塊周圍形成較大生長(zhǎng)暈,隨之細(xì)胞生長(zhǎng)較快,可根據(jù)培養(yǎng)液顏色變化,補(bǔ)加和更換培養(yǎng)液。如細(xì)胞生長(zhǎng)良好,約10-15天可長(zhǎng)成致密單層,這時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。5.思考題⑴簡(jiǎn)述細(xì)胞原代培養(yǎng)法的主要步驟。⑵在細(xì)胞培養(yǎng)中怎樣防止污染?

實(shí)驗(yàn)七、人類染色體核仁組織區(qū)銀染技術(shù)1．目的要求了解銀染顯示核仁形成區(qū)的原理和方法,加深理解核仁形成區(qū)的特性及其與核仁形成、核糖體產(chǎn)生的關(guān)系。掌握人類染色體核仁形成區(qū)的銀染技術(shù)。2．實(shí)驗(yàn)原理成熟核糖體大小亞基中的28S、18SrRNA和5．8SrRNA是由處在核仁中的RNA基因(rDNA)轉(zhuǎn)錄合成后加工而成。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分裂期時(shí),28S+18SrRNA基因所在的DNA分子參與組裝人類的5對(duì)近端著絲粒染色體(13、14、15、21、22號(hào))的著絲粒區(qū)。當(dāng)細(xì)胞分裂進(jìn)入間期時(shí),位于這些部位的rRNA基因參與核仁的形成,故將染色體上與核仁形成有關(guān)的節(jié)段稱為核仁形成區(qū)(NOR)。由于具轉(zhuǎn)錄活性或已轉(zhuǎn)錄過(guò)的rRNA基因往往伴有豐富的酸性蛋白質(zhì),而且這類蛋自質(zhì)含有一SH基團(tuán)和二硫鍵,易將硝酸銀中的Ag+還原成Ag顆粒,故有活性的核仁形成區(qū)常被硝酸銀鍍上銀顆粒而呈現(xiàn)黑色。無(wú)轉(zhuǎn)錄活性的NOR則不被著色。利用硝酸銀(AgNO3)可將具轉(zhuǎn)錄活性的核仁形成區(qū)(rRNA基因)特異性地染成黑色,人們將這種銀染陽(yáng)性的核仁形成區(qū)稱為Ag一NOR,它是具有轉(zhuǎn)錄活性的18SrRNA和28SrRNA基因所在的部位。利用銀染核仁形成區(qū)技術(shù)還能準(zhǔn)確地判斷人體細(xì)胞中是否存在近端著絲粒染色體隨體的聯(lián)合(Ag-AA),這種聯(lián)合可能是造成近端著絲粒染色體不分離、斷裂和易位的原因。利用銀染技術(shù)可清楚地看到發(fā)生聯(lián)合的染色體間有銀染物質(zhì)相連,故可將其作為近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合的客觀標(biāo)準(zhǔn)。Ag-NOR的頻率是細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性的rRNA基因數(shù)的量值,而Ag-AA的頻率則是rRNA基因活性大小的量值。3．材料用品⑴器材:光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、培養(yǎng)皿、蓋玻片⑵標(biāo)本:未染色的人類染色體標(biāo)本(片齡一周以內(nèi))⑶試劑:50%硝酸銀溶液、明膠顯影液4．操作過(guò)程⑴取一張片齡在一周內(nèi)的染色體玻片標(biāo)本(新鮮的標(biāo)本片染色效果更好),在片上滴加2滴明膠顯影液,然后加4滴50%硝酸銀溶液,輕搖標(biāo)本片,使兩液混勻后,即蓋上蓋玻片。⑵將標(biāo)本片放在68~70°⑶取下標(biāo)本片,用蒸餾水沖去蓋玻片及多余染液,自然晾干。⑷觀察分析:在顯微鏡下可見(jiàn)間期核和中期分裂相的染色體被染成黃色,核仁被染成黑色,某些染色體上有銀染黑點(diǎn),即核仁形成區(qū)。①Ag-NOR的計(jì)數(shù):選擇銀染著色良好且D組和G組染色體數(shù)目完整的中期分裂相,統(tǒng)計(jì)D組的6個(gè)和G組的4個(gè)近端著絲粒染色體的Ag-NOR數(shù)目。凡是NOR處有銀染點(diǎn)的近端著絲粒染色體,無(wú)論是單側(cè)或雙側(cè),都計(jì)數(shù)為一個(gè)Ag-ROR。②Ag-AA的計(jì)數(shù):凡近端著絲粒染色體之間有銀染物質(zhì)相連或連絲的,均計(jì)為Ag-AA。而近端著絲粒染色體之間雖然非常接近,但無(wú)銀染物質(zhì)相連或連絲的,均不計(jì)為Ag-AA。涉及兩條近端著絲粒染色體的聯(lián)合,計(jì)作1個(gè)Ag-AA;涉及3條近端著絲粒染色體的聯(lián)合,如未形成閉環(huán),計(jì)為2個(gè)Ag-AA;3條近端著絲粒染色體聯(lián)合且形成閉環(huán)者,計(jì)為3個(gè)Ag-AA,余類推。在分析Ag-AA時(shí),應(yīng)區(qū)分是D-D、D-G,還是G-G聯(lián)合。5．作業(yè)與思考1．計(jì)數(shù)10個(gè)人類染色體中期分裂相中Ag-AA和Ag-NOR的數(shù)目。2．繪一個(gè)油鏡下中期分裂相,注明Ag-NOR的位置、數(shù)目和形態(tài)。

實(shí)驗(yàn)八．植物愈傷組織的誘導(dǎo)和分化1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馀囵B(yǎng)基的配制過(guò)程;掌握植物外植體的選擇和表面消毒方法;掌握無(wú)菌條件下愈傷組織的誘導(dǎo)操作方法;了解植物組織脫分化過(guò)程中的形態(tài)變化特點(diǎn)。2.實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)植物細(xì)胞的全能性,利用植物激素中的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等兩類重要激素的不同配比,人為控制細(xì)胞的分裂和分化方向,實(shí)現(xiàn)對(duì)植物細(xì)胞和組織的脫分化、再分化和生根等。本實(shí)驗(yàn)以煙草葉片為外植體,進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo),即葉片組織的脫分化實(shí)驗(yàn),以便掌握基本的植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作方法。另外,自1973年基因工程誕生以來(lái),煙草易于進(jìn)行組織培養(yǎng)、容易得到轉(zhuǎn)化植株而成為典型的基因工程模式植物,加之由于其蛋白含量高,被普遍認(rèn)為是理想的生物反應(yīng)器受體植物。經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)煙草將具有重要意義。3.實(shí)驗(yàn)材料,儀器和試劑⑴實(shí)驗(yàn)材料自然生長(zhǎng)的煙草苗。⑵實(shí)驗(yàn)器具高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、光照培養(yǎng)箱、酒精燈、鑷子、脫脂棉、打火機(jī)、量筒、移液管、錐形瓶(滅菌)、培養(yǎng)皿(滅菌)、無(wú)菌濾紙、封口膜、橡皮筋、分析天平。實(shí)驗(yàn)藥品和試劑70%酒精、20%NaClO、無(wú)菌水,培養(yǎng)基配制用藥品見(jiàn)附件。4.實(shí)驗(yàn)步驟⑴MS培養(yǎng)基的配置煙草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+6-BA2mg/L+NAA2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8mg/L。煙草愈傷組織誘導(dǎo)所用的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。各種MS母液和激素母液均按附件中的配方配制。煙草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基按下表配制:試劑用量(1000ml)MS無(wú)機(jī)大量元素(20×)50mlMS無(wú)機(jī)微量元素(1000×)1mlMS銅鈷