馮學亮教授課件

百令膠囊菌種鑒定報告

及抗腎纖維化作用的研究西安交大醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院馮學亮2009年10月27日冬蟲夏草冬蟲夏草是一種昆蟲和真菌的復合體.被寄生的蟲體是蟲草蝙蝠蛾的幼蟲.寄生的真菌是冬蟲夏草菌(cordycepssinensis(BerK.)Sacc.),它屬于真菌門,子囊菌綱,肉座菌目,麥角菌科,蟲草菌屬,冬蟲夏草種.

8月左右雪線以下，陰坡半陰坡5月5-15日8-9月間3-10攝氏度子囊孢子感染蝙蝠蛾幼蟲菌核（10月到次年五月,菌絲束）子座7月下旬子囊成熟分生孢子

長出牙管僵蟲冬蟲夏草生活史形成僵蟲過程2～3天內

長出牙管冬蟲夏草生活史公元780年，藏醫(yī)藥學名著《月王藥診》：“治肺部疾病”。1757年，清·吳儀洛《本草從新》“冬蟲夏草味甘性平，入肺腎二經(jīng)，保肺益腎、補精髓、止血化痰，已勞嗽，治膈癥皆良?！?765年，清·趙學敏《本草綱目拾遺》“冬蟲夏草治膈癥、蠱脹?！倍x夏草的藥用價值古代70多部中藥學文獻把冬蟲夏草的功用歸納為:"能陰陽并補，治勞嗽膈癥，諸虛百損；功與人參、鹿茸同，但藥性溫和，老少病虛者皆宜食用……。"同時，新中國建立以來，我國有200多部藥書詳細記載了冬蟲夏草的藥效與用途。冬蟲夏草的藥用價值冬蟲夏草的有效成分蟲草酸（甘露醇）、蟲草素（腺苷）、蟲草多糖、腺嘌呤、尿嘧啶、多球殼菌素;維生素B1、B2、B12、E等;還有人體必需的微量元素鋅、錳、鉀、磷等;以及多種必需的氨基酸等。蟲草酸：具有促進機體新陳代謝，清除自由基，抗過氧化損傷作用；蟲草素：具有抗菌.抗癌活性的核苷類物質，對核多聚腺苷酸聚合酶有很強的抑制作用。抑制細菌和癌細胞生長。清除自由基，抗過氧化損傷作用,還有一定的降血糖作用;蟲草多糖：能促使淋巴細胞轉化，提高血清IgG的抗體含量和機體的免疫功能，增強機體自身抗癌,抑癌的能力?？估w維化作用;腺苷：具有舒張血管、降低血壓、減慢心律,對心律有雙向調節(jié)作用;

冬蟲夏草野生資源逐年萎縮據(jù)統(tǒng)計，20世紀50年代以前全國年產(chǎn)量曾達100噸以上，60年代初為50噸至80噸，到90年代僅有5噸至15噸。雖然有關部門將冬蟲夏草列為國家二級保護物種，各地政府也出臺政策禁挖、限挖，但對冬蟲夏草的采挖并未得到遏制。目前世界上已發(fā)現(xiàn)同屬“蟲草屬”的蟲草已有三百五十種之多，其中在中國已發(fā)現(xiàn)過六十余種，包含：冬蟲夏草和蟲草冬蟲夏草（C.sinensis）北冬蟲夏草(C.militaris)大團蟲草（C.ophioglossoides）亞香棒蟲草(C.hawkesii)

古尼蟲草(C.gunnii)

珊瑚蟲草(C.martialis)鐮刀狀蟲草(C.falcata)泰山蟲草(C.taishanensis）山西蟲草(C.shanxiensis)

涼山蟲草(C.liangshanensis)新疆蟲草(C.gracilis)

香棒蟲草(C.barnesii)等……蟬花分布于安徽（淮北）、四川（都江堰）以及云南、江蘇、浙江、福建和湖北等省。蛹蟲草分布于河北、吉林、陜西、安徽、云南、廣西、貴州、四川、臺灣以及廣東、湖北、湖南和山西等省。冬蟲夏草和蟲草蟻蟲草分布于安徽、江蘇、浙江、四川、云南、廣西、廣東和湖北等省。下垂蟲草分布于吉林、安徽、湖北、浙江、貴州、四川、廣西、和海南等省。冬蟲夏草和蟲草冬蟲夏草和蟲草金龜子蟲草黃蜂蟲草大團囊蟲草珊瑚蟲草雖然已發(fā)現(xiàn)的品種繁多，但其中具有藥用價值的品種卻并不多；有些還具有毒性，錯誤服用后可能會直接破壞人體的肌體功能。冬蟲夏草和蟲草最具有價值的是：

冬蟲夏草（Cordycepssinensis（Berks.）Sacc.）冬蟲夏草雖然藥用價值較高，但因其數(shù)量有限，價格過于昂貴,畢竟不能進入尋常百姓之家。中科院微生物研究所開展的《冬蟲夏草及其相關類群的分子系統(tǒng)學分析》的課題已經(jīng)證明：百令膠囊生產(chǎn)菌就是天然冬蟲夏草的無性型。冬蟲夏草VS百令膠囊從已知的化學成分看,其生物活堿、甾醇、甘露醇、微量元素、氨基酸的含量和百分比都與天然冬蟲夏草一致。冬蟲夏草及其相關類群的分子系統(tǒng)學分析魏鑫麗,印象初,郭英蘭,沈南英,魏江春<<菌物學報>>2006年第25卷第02期國家創(chuàng)新經(jīng)費贊助(編號0110)實驗背景藥用真菌的物種科學名稱是否準確,是一個國家真菌科學水平的標志,更是能否保護我國自主知識產(chǎn)權的關鍵。中華束絲孢與中國被毛孢是否等同？印象初院士于2001年10月18日上午約魏江春院士交談上述問題，建議魏江春院士能主持澄清上述學術爭議問題。中國科學院真菌與地衣系統(tǒng)學開放實驗室1990年的學術委員會年會上立項問題。Hirsutellahepialichenetshen,sp.nov

中國被毛孢（百令）Paecelonvyceshepiali

蝙蝠蛾擬青霉（金水寶）Mortierellahapialia

蝙蝠蛾被孢霉（至靈）Cephalosporiumdongchongxiacao

蟲草頭孢菌（寧心寶）等等。。。市場上冬蟲夏草菌種很多，也很混亂人工蟲草研究目標Ⅰ中華束絲孢與冬蟲夏草之間的親緣關系？冬蟲夏草菌Cordycepssinensis中國被毛孢Hirsutellasinensis中華束絲孢Synnematiumsinense親緣關系？蝙蝠蛾擬青霉與冬蟲夏草之間的親緣關系？蝙蝠蛾擬青霉Paecilomyceshepiali親緣關系？研究目標Ⅱ冬蟲夏草菌Cordycepssinensis中國被毛孢Hirsutellasinensis產(chǎn)品名生產(chǎn)菌說明至靈膠囊蝙蝠蛾被孢霉被孢霉屬真菌，在親緣關系上與子囊菌相距甚遠，屬于結合菌門成員。心肝寶膠囊粉紅膠霉“粉紅膠霉”是一種真菌寄生菌；膠霉屬是肉座菌科小燦球赤殼菌屬的無性型。寧心寶膠囊蟲草頭孢根據(jù)其發(fā)酵生產(chǎn)周期為3－5天以及溫度為25－35℃便可推知，并非冬蟲夏草菌的無性型。無論是至靈、寧心寶和心肝寶膠囊的生產(chǎn)菌均非冬蟲夏草菌的無性型分子水平一致編號菌株號名稱產(chǎn)地有性型S4=Cs-Q無冬蟲夏草（Cordycepssinensis(Berk.)Sac.）

青海G3=Cs-S無冬蟲夏草（Cordycepssinensis(Berk.)Sac.)四川無性型G2=Hs-SGuo-2中國被毛孢（HirsutellasinensisLiuetal.）

四川S1=Ss-Q0207中華束絲孢（SynnematiumsinenseYin&Shen）

青海S2=Ss-Q上020中華束絲孢

(SynnematiumsinenseYin&Shen)

青海S3=SsKD0205F9中華束絲孢

(SynnematiumsinenseYin&Shen)青海S5=PhCs-4蝙蝠蛾擬青霉（PaecilomyceshepialiChenetDai）青海外群G4=Pm-Guo無蛹草擬青霉（PaecilomycesmilitarisLiang）

吉林供試材料編號、名稱、產(chǎn)地及提供者總DNA提?。翰捎酶牧糃TAB法（Rogers&Bendich,1988）。DNA隨機擴增多型性(RAPD)分析擴增反應：95℃5分鐘，1個循環(huán)，94℃，1分鐘，36℃1分鐘，72℃2分鐘，40個循環(huán)；最后72℃2分鐘。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，80V，2小時。隨機引物的選用：從華美公司試劑盒中選擇了6個隨機引物：

S23（AGTCAGCCAC），

S33（CAGAACCCAC），

S61（TTCGAGCCAG），

S146（AAGACCCCTC），

OPW-06（AGGCCCGATG），

OPV-14（AGATCCCGCC）。RAPD反應體系（25μl）含有：25mMMgCl21.5μl，2.5mMdNTP1.5μl，10μM引物2μl，10×Buffer2.5μl，3U/μlTaq酶0.5μl，模板（稀釋50倍）0.5μl，無菌去離子水16.5μl。6個隨機引物的圖譜利用PAUP分析6條引物的RAPD圖譜所得的樹型圖（Distancemethod；bootstrap=1000；UPGMA），節(jié)間數(shù)字代表bootstrap值。分子水平一致PCR擴增、測序及分析：通過PCR從供試菌株總DNA中進行核rDNAITS區(qū)(ITS1-5.8S-ITS2)堿基序列的擴增；引物選用ITS4和ITS5(Whiteetal.,1990)；PCR產(chǎn)物由上海博亞和基康公司測序。測序結果利用軟件DNAMAN4.0進行比對；利用Mega2進行系統(tǒng)學分析（Kumaretal.,2001）；采用Kimura2-parameter模式，存在缺失時成對刪除；構建系統(tǒng)關系樹采用NJ法，重復運算1000次（bootstrap=1000）。nrDNA間隔區(qū)(ITS)序列分析rDNAgene結構模式圖123456789101112細菌古菌真核生物保守區(qū)(相似性70%以上)高變區(qū)16S16SISR23SISR23S17S-18S5.8SITS1ITS225S-28S中間省略……分子水平一致分子水平一致節(jié)間數(shù)字代表bootstrap值（低于50％因不是同一類群而未標識）。分子水平一致內群1冬蟲夏草

Cordycepssinensis中國被毛孢

Hirsutellasinensis外群2蝙蝠蛾擬青霉

Paecilomyceshepiali外群3蛹草擬青霉

Paecilomycesmilitaris建議鑒于具有創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn),為了保護知識產(chǎn)權,提出下列建議：I、百令膠囊：

1、將百令膠囊生產(chǎn)菌的菌種名稱盡快更正為:中國被毛孢（HirsutellasinensisLiuetal.

）

2、將百令膠囊的成分更正為：冬蟲夏草發(fā)酵菌粉II、金水寶膠囊：

1、鑒于具有創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn),建議將金水寶膠囊生產(chǎn)菌蝙蝠蛾擬青霉的拉丁學名PaecilomyceshepialiChenetDai（不合格名稱）盡快進行合格化發(fā)表,以實現(xiàn)該名稱的合法性，從而得到保護名稱和自主知識產(chǎn)權的。

2、將金水寶膠囊成分更正為：蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵菌粉III、為國家藥監(jiān)部門提出建議百令在基礎和臨床方面的研究日益受到關注。90年代以來在國家級的雜志上作為論著文章累計150余篇。主要臨床功用體現(xiàn)在以下方面：百令在醫(yī)學領域的廣泛應用腎內科：有效改善腎功能，拮抗腎纖維化。移植科：促進細胞增生，防治CsA腎毒性。呼吸科：降低氣道阻力，提高肺順應性。肝科：抗纖維化，抗氧化。腫瘤科：拮抗毒性，升白，提高機體免疫功能。內分泌：治療自身免疫性甲狀腺疾病。等等……蟲草菌液拮抗馬兜鈴酸對人近端腎小管上皮細胞的作用芮宏亮諶貽璞等中華腎臟病雜志2006年8月第22卷第8期國家自然科學基金項目(No.30170429)衛(wèi)生部屬(管)醫(yī)療機構臨床學科重點項目(2005-2007年度)方法及材料采用體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞系HKC細胞。馬兜鈴酸鈉鹽(AA)刺激細胞濃度為40mg/ml。冬蟲夏草菌液由杭州中美華東制藥有限公司提供。刺激細胞時藥物濃度為10mg/ml。此二種藥物試驗前均已進行細胞增殖作用及毒性效應檢測(MTT試驗及LDH試驗)。芮宏亮諶貽璞等,中華腎臟病雜志2006年8月第22卷第8期實驗指標CTGF是TGF-β發(fā)揮前纖維化活性的一個重要下游因子。PAItPATIMP纖溶酶MMPECM降解芮宏亮諶貽璞等,中華腎臟病雜志2006年8月第22卷第8期實驗流程HKC細胞A:對照組B:蟲草菌液組C:馬兜鈴酸組D:馬兜鈴酸＋蟲草菌液組刺激12小時后刺激36小時后裂解細胞，用RT-PCR測定TGF-β1、CTGF、PAI-1和TIMP-1mRNA表達收集上清，用ELISA法測定TGF-β1、PAI-1和TIMP-1蛋白質表達裂解細胞，用Westernblot測定CTGF蛋白質表達統(tǒng)計、分析芮宏亮諶貽璞等,中華腎臟病雜志2006年8月第22卷第8期TGF-β1mRNA表達變化ABCDβ-ActinTGF-β1A組：對照組B組：蟲草菌液組C組：AA組D組：AA+蟲草菌液組MTGF-beta1mRNA*#與對照組比較*p<0.05與AA組比較

#p<0.05(n=3)芮宏亮諶貽璞等,中華腎臟病雜志2006年8月第22卷第8期TGF-β1蛋白質表達變化A組：對照組B組：蟲草菌液組C組：AA組D組：AA+蟲草菌液組TGF-beta1(ng/L)與對照組比較*p<0.05與AA組比較

#p<0.05(n=4)*#*芮宏亮諶貽璞等,