不同溫度環(huán)境下不同新鮮糞樣生殖激素檢測結果比較

不同溫度環(huán)境下不同新鮮糞樣生殖激素檢測結果比較

生殖激素與動物繁殖密切相關，并直接或間接地參與動物的繁殖和繁殖。生殖激素的活動指揮著生殖系統(tǒng)的發(fā)育,以實現(xiàn)繁殖后代的功能。一般情況下,動物機體內的生殖激素含量在發(fā)情周期有著明顯的變化規(guī)律,通過檢測發(fā)情周期生殖激素含量的變化,可以了解和指導動物的繁殖活動。國內外很多研究人員對野生動物糞樣生殖激素檢測與繁殖行為之間的關系做了大量研究,但是,野生動物糞樣保存的溫度對糞樣激素的檢測結果是否存在影響則少見報道。本文以雌性成年華南虎(Pantheratigrisamoyensis)的新鮮糞樣為試驗對象,將在不同溫度環(huán)境中保存的糞樣,用CatELISAKit檢測糞樣中雌二醇(E)、孕酮(P)、黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的濃度,并分析環(huán)境溫度對糞樣中糖蛋白激素和類固醇激素的影響,為野生動物的糞樣采集和保存提供科學依據。1材料和方法1.1elisa試劑盒21份新鮮糞便樣品均采自福州動物園1只雌性成年健康華南虎排泄的糞便。ELISA試劑盒(CatEELISAKit,CatPROGELISAKit,CatLHELISAKit,CatFSHELISAKit)購自森貝伽生物公司。1.2方法1.2.1糞樣的采集和預處理將不同日期采集的7份新鮮糞樣,每份糞樣采集后1h內及時分裝2管清潔干燥的西林瓶中,每管2g,編號。每份糞樣各取1管直接真空冷凍干燥凍干24h(A組)。每份糞樣的另1管先置于-20℃冰箱保存24h后,真空冷凍干燥凍干24h(B組),待測。將不同日期采集的4份新鮮糞樣,每份糞樣采集后1h內分裝4管清潔干燥的西林瓶中,每管2g,編號。每份糞樣分別置于25℃(C組),4℃(D組),-20℃(E組),-70℃(F組)保存24h后,真空冷凍干燥凍干24h,待測。將不同日期采集的5份新鮮糞樣,每份糞樣采集后1h內分裝5管清潔干燥的西林瓶中,每管2g,編號。將5份糞樣(G組～K組)置于-20℃保存,保存期9d。在保存期內每隔1d取1管真空冷凍干燥凍干24h,待測。將不同日期采集的5份新鮮糞樣,每份糞樣采集后1h內分裝5管清潔干燥的西林瓶中,每管2g,編號。將5份糞樣(L組～P組)置于4℃保存,保存期9d。在保存期內每隔1d取1管真空冷凍干燥凍干24h,待測。上述凍干的糞樣用研缽研細,過篩去除雜質。用電子秤稱取0.1g裝入2mL和10mL的離心管中,分別用于測定糖蛋白激素(卵泡刺激素和黃體生成素)和類固醇激素(雌二醇和孕酮)。1.2.2提取激素1.2.2.離心水浴將裝有0.1g糞樣的10mL離心管內加入5mL90%乙醇,振蕩至固液充分混合,2400r/min離心10min。置于90℃水浴20min,振蕩均勻。2400r/min離心20mim,將上清液移入10mL離心管。重復上一步驟,2400r/min離心20mim,取上清液1mL,置于真空烘箱50℃烘干,加入1.5mLPBS沉淀,待測。1.2.2.離心管的制備將裝有0.1g糞樣的2mL離心管內加入1.5mL0.9%NaCl,振蕩至固液充分混合,3000r/min離心20min,取上清液至10mL的離心管。重復上一步驟,3000r/min離心20min,取上清液待測。1.2.3elisa東南角兩大細胞菌中he,p,cat的表達將待測樣品用ELISA方法檢測,OD450nm處讀值。CatEELISAKit測定雌二醇(E),CatPROGELISAKit測定孕酮(P),CatLHELISAKit測定黃體生成素(LH),CatFSHELISAKit測定卵泡刺激素(FSH)。1.2.4處理數據運用Excel數據處理,SPSS1l.5進行Paired-SamplesTTest和One-WayANOVA統(tǒng)計分析。2結果與分析2.1生成素測定結果直接冷凍干燥(A組)和置于-20℃保存24h后冷凍干燥(B組)的糞樣中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素測定結果見表1。Paired-SamplesTTest分析結果表明,2種保存方法對糞樣中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素含量影響甚微,統(tǒng)計結果表明,兩者間差異均不顯著(P>0.05)。2.2糞樣中生成素測定25℃(C組),4℃(D組),-20℃(E組)和-70℃(F組)條件下保存24h后,真空冷凍干燥凍干24h的糞樣中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素含量測定結果見表2。One-WayANOVA分析結果表明,雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素在25℃,4℃,-20℃和-70℃溫度條件下保存,差異均不顯著(P>0.05)。2.3生成素測定結果-20℃保存的糞樣,保存第1天(G組),第3天(H組),第5天(I組),第7天(J組)和第9天(K組)真空冷凍干燥凍干24h后雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素含量測定結果見表3。One-WayANOVA分析結果表明,華南虎糞樣在-20℃下保存9d內雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素均無顯著差異(P>0.05)。2.44生成素測定結果4℃保存的糞樣,保存第1天(L組),第3天(M組),第5天(N組),第7天(0組)和第9天(P組)真空冷凍干燥凍干24h后雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素含量測定結果見表4。One-WayANOVA分析結果表明,華南虎糞樣在4℃下保存9d內雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素均無顯著差異(P＞0.05)。3氣體、局部和生成素檢測張洪海等人利用放射性免疫分析法(RIA)檢測東北虎糞樣中雌二醇和睪酮含量,將新鮮糞樣置于-20℃保存。于鴻浩等人建立了糞樣中激素的提取和高效液相色譜測定的方法,將采集的藏羚羊(TibetanAntelope)的新鮮糞便置于-80℃保存。崔媛媛等認為,一般情況下,糞樣保存溫度建議為4℃或-20℃。郎冬梅利用ELISA檢測林麝(Moschusberezovskii)糞樣中的孕酮的含量,結果表明孕酮在室溫保存數小時內會呈上升趨勢,之后會呈下降趨勢。本研究將雌性華南虎新鮮糞樣置于4個不同溫度(25℃,4℃,-20℃和-70℃)保存24h,檢測糞樣中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素,結果表明,各處理間均無明顯差異。研究結果與前人的觀點存在差異,其原因可能與檢測的方法和測定條件不盡相同所致。迄今,糞樣處理最簡便易行的方法是使用真空冷凍干燥機(-60℃,24h)進行冷凍干燥。雖然已有研究表明,糞樣保存的濕度比溫度影響小,以及干燥糞樣與冷凍儲藏糞樣生殖激素含量有較顯著的相關性。本研究將雌性華南虎新鮮糞樣分別做直接凍干和保存于-20℃后再凍干,糞樣中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素兩者間無明顯差異。將雌性華南虎新鮮糞樣-20℃保存9d和4℃保存9d,兩者糞樣中雌二