端粒長度對細(xì)胞增殖能力的影響

端粒長度對細(xì)胞增殖能力的影響

段粒是線性真核細(xì)胞染色體的自然末端，與細(xì)胞的生存化和細(xì)胞的衰老有關(guān)。人胚胎細(xì)胞可以表達(dá)端粒酶并維持穩(wěn)定的平均端粒長度,其最初端粒長度可以確定體細(xì)胞的復(fù)制性壽命。在體細(xì)胞內(nèi),常常無端粒酶活性,端粒重復(fù)序列會隨每次細(xì)胞分裂而漸進性丟失,最終使染色體完整性喪失,細(xì)胞增殖停止。這說明端粒的縮短與高等真核生物中正常體細(xì)胞增殖的限制相關(guān),這種有限的細(xì)胞分裂能力已經(jīng)在許多實驗中得到證實。材料和方法1.皮膚正常皮膚和正常嘴唇腺的檢測老年組年齡60歲至70歲;嬰幼兒組年齡范圍在出生后3個月至2.5歲。老年組正常皮膚表皮有27份,均來自頜面部整形手術(shù)及因腫瘤、外傷后而進行的整復(fù)術(shù)所切除的正常皮膚;嬰幼兒組正常皮膚表皮有30份,來自唇裂整復(fù)術(shù)及其他手術(shù)所切除的正常皮膚。老年組正常腮腺30份,均來自多形性腺瘤手術(shù)摘除的部分正常腮腺;嬰幼兒組正常腮腺21份,均來自腮腺血管瘤手術(shù)而摘除的腺體,每組性別不限。2.案件間雜交信號加強和分子鑒定參考Hiyama方法進行測定。常規(guī)方法提取DNA,用適量HinfI,在37℃下徹底酶切1小時。取一定量已酶切的DNA在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳,然后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素濾膜上,經(jīng)預(yù)雜交后,再與[r-p32]-dATP標(biāo)記的探針(TTAGGG)4進行Southern雜交,再進行放射自顯影,比較每條泳道上位于15kb-1kb間雜交信號最強的位置區(qū)域。經(jīng)HinfI酶切的DNA產(chǎn)生了含有完整的端粒重復(fù)序列的末端限制酶切片斷及一部分含有TTAGGG樣序列的亞端粒DNA片斷。由于一塊組織中含有大量細(xì)胞,每個細(xì)胞中的端粒長度是不同的,變化較大。Southern雜交信號最強處實際上是TTAGGG含量最豐富處。每個DNA片斷所含端粒重復(fù)序列的數(shù)量是與DNA長度相應(yīng)的,因此,我們參考前人的實驗方法并做一些改變,將雜交信號最強區(qū)域的中間帶處的DNA長度作為每份標(biāo)本的端粒限制性片斷長度。通過TRF值間接測得近似的每份標(biāo)本的端粒長度,然后計算每組平均TRF值,并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。HinfI酶及(TTAGGG)4探針由大連寶泰克生物公司合成,[r-p32]-dATP由北京亞輝公司提供。皮膚表皮trf長度的變化每份樣品的雜交信號都在一個較寬的范圍內(nèi)分布(15kb-1kb),由雜交信號較強的沫跡和雜交信號較清晰條帶組成。沫跡是由含有端粒樣結(jié)構(gòu)的亞端粒與探針雜交所致;而清晰的條帶是由端粒本身重復(fù)序列與探針雜交所致。同一年齡組中,不同組織的平均TRF長度是不同的。在嬰幼兒組中,皮膚表皮的平均TRF長度為9.46±0.64kb;而腮腺的平均TRF長度為8.8±0.44kb。在老年組中,皮膚表皮的平均TRF為8.20±1.22kb;而腮腺的平均TRF為8.62±0.64kb。在嬰幼兒組中,每份皮膚表皮TRF值及腮腺標(biāo)本TRF值分布較平均;而在老年組中,每份表皮TRF值和每份腮腺TRF值的分布不十分勻稱,有4份表皮TRF短于5.5kb,5份表皮TRF長于8.5kb,有3份腮腺TRF短于5.5kb。在兩個不同年齡分組中,皮膚表皮的TRF平均值隨年齡增長而呈下降趨勢,表現(xiàn)出從總體趨勢上與年齡有關(guān)。而腮腺腺體的TRF平均值不隨年齡增長而出現(xiàn)變短趨勢。兩個不同年齡組中的表皮TRF平均值間均有顯著性差異;而腮腺腺體TRF平均值間無統(tǒng)計學(xué)意義。皮膚表皮trf含量的變化細(xì)胞衰老的端粒假設(shè)理論是由Olovnikov首先提出,他認(rèn)為人體細(xì)胞染色體長期穩(wěn)定依賴于端粒重復(fù)序列的增加,端粒酶活性存在于胚胎細(xì)胞中,但在多數(shù)體細(xì)胞中則無。由于末端復(fù)制問題,正常體細(xì)胞染色體會隨細(xì)胞的每次分裂而有一段端粒重復(fù)序列丟失,體細(xì)胞中染色體漸進性縮短可導(dǎo)致重要基因丟失,經(jīng)過有限次分裂后端粒縮短至某一關(guān)鍵區(qū)時,啟動了生長停滯信號引起細(xì)胞分裂停止,細(xì)胞退出細(xì)胞分裂周期而衰老死亡。因此,有學(xué)者提出正常人體細(xì)胞端粒長度可作為衡量細(xì)胞有絲分裂能力的“生物鐘”,其機理目前不十分清楚。大量實驗證明在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞及其他在體體細(xì)胞中,包括皮膚表皮細(xì)胞、外周血白細(xì)胞及結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞,隨供體年齡增長,均有有端?？s短發(fā)生。我們測定了不同年齡供體正常頜面部皮膚表皮細(xì)胞中的TRF,發(fā)現(xiàn)隨年齡增長,TRF值降低。細(xì)胞端?？s短是控制細(xì)胞壽命的主要原因。皮膚表皮是生理功能較旺盛的組織,在人的一生中不斷更新,其更新速率較快。表皮的增殖是靠其增殖單位內(nèi)的干細(xì)胞-中央基底細(xì)胞的衍生而來。老年人皮膚有以下特點:再生能力較低,分裂旺盛的細(xì)胞成份少,衰老角化的細(xì)胞多,皮膚表皮生理性脫落緩慢,角化層變厚,多倍體細(xì)胞數(shù)量增多及老年人易患皮膚癌;而嬰幼兒皮膚表皮中分裂旺盛的細(xì)胞成份多,表皮的更新生理性脫落速度快,衰老、角化的殘留細(xì)胞少,因此老年組皮膚表皮細(xì)胞的TRF均值比嬰幼兒組皮膚表皮的TRF均值低,有顯著性差異,本文結(jié)果也證實了這一點。在兩個不同年齡組的腮腺中,末發(fā)現(xiàn)老年組的腮腺TRF均值比嬰幼兒組的TRF均值顯著降低。在不同組織中,隨年齡變化,兩組的平均TRF表現(xiàn)出完全不同的趨向。我們推測這種不同是由端粒長度調(diào)節(jié)基因所致,不同組織的TRF長度是分別獨立自身調(diào)節(jié)的。腮腺組織也是靠干細(xì)胞的分裂來更新,但是腮腺內(nèi)干細(xì)胞的分裂次數(shù)很少,其組織更新率不象皮膚表皮那樣快,因此,干細(xì)胞一旦分化成為腺泡細(xì)胞后,具有極長的生命期,其分裂周期長而緩慢,結(jié)果,其平均TRF長度隨年齡增長不會出現(xiàn)明顯的縮短,除個別實驗對象會表現(xiàn)出明顯的TRF縮短,但從總體上,其TRF均值間無顯著差異。這種不同組織TRF值的差異是由于兩種組織不同的生理性質(zhì)及其細(xì)胞分裂能力決定的,不是由年齡決定的。老年組部分腮腺組織TRF值降低,除可能與個體差異有關(guān)外,可能還與全身或局部疾病相關(guān)。細(xì)胞倍增數(shù)量的降低,很可能反映出不同年齡供體體內(nèi)細(xì)胞復(fù)制潛能的降低。這提示體細(xì)胞中的端粒長度與供體年齡相關(guān)性不大,而是細(xì)胞復(fù)制潛能的指標(biāo)。Allospp也證明TRF長度是體細(xì)胞復(fù)制能力的最好指標(biāo)。另外,還有實驗證明端粒長度及細(xì)胞的復(fù)制能力在早老性病人的成纖維細(xì)胞中均有降低。這進一步說明端粒長度是細(xì)胞衰老的生物指標(biāo),而不是供體年齡的指標(biāo)。實驗中所測的TRF值是細(xì)胞群體的平均TRF,平均TRF的計算應(yīng)保證所得的平均TRF值內(nèi)的TTAGGG重復(fù)序列的量與所測得值的長度相適宜。由于沒有一個可靠的直接測量端粒長度的方法,人們常用平均TRF長度來檢查末端重復(fù)序列的長度變化,而且端粒序列的丟失常常伴隨雜交信號強度的降低。所以,本實驗在參考前人的實驗方法同時,做一些修改,取雜交信號最強區(qū)的中間位置作為TRF值的測量標(biāo)準(zhǔn),以便能更近似正確地表達(dá)出每份樣品的端粒長度。另外,由于不同端粒中非TTAGGG成份的長度不同,以及在TRF附近區(qū)域中有TTAGGG的存在,導(dǎo)致端粒探針可以與4-5kb以下的某些TRF雜交,故每份標(biāo)本的雜交信號分布范圍較廣。對于多種有機體來說,端粒重復(fù)序列的數(shù)目不同,導(dǎo)致端粒長度不均一。不同種類的細(xì)胞,其端粒長度有著明顯的不同?？刂贫肆ｉL度的決定因素是對端粒特異的DNA聚合酶,即端粒酶。端粒長度的維持靠多水平的調(diào)整,除端粒酶外,還有端粒結(jié)合蛋白,雙鏈和單鏈端粒結(jié)合蛋白調(diào)整端粒酶通向染色體末端的途徑,從而影響細(xì)胞分裂周期、生長及發(fā)育。最近Bryan等發(fā)現(xiàn)40%的永生化細(xì)胞無端粒酶活性,但這些細(xì)胞具有很長且長短不一的端粒,其詳細(xì)