苯酚-硫酸法測定蒙藥清熱八味散粗多糖的含量

苯酚-硫酸法測定蒙藥清熱八味散粗多糖的含量

蒙古藥物種類繁多，資源豐富，分布廣泛。它主要來自自然界植物、動物和礦物，主要以植物藥物為主。蒙藥是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分。明代的清熱八味散（蒙語為額日二味散）是保存和使用于西藏和蒙古醫(yī)學(xué)的重要藥物。清熱八味散主要由檀香山、石膏、紅花、苦丁、曲麥、胡黃蓮、麥冬、人工黃連等八味散組成。主要用于清熱解毒、熱、血熱、臟腑熱、肺熱、咳嗽、痰中出血、肝灼燒、肋骨疼痛等疾病。蔡光明等人在開發(fā)、分離、提取、結(jié)構(gòu)、藥理學(xué)研究等方面做了大量工作。蔡光明等人研究了蒙古族清熱八味散對大鼠免疫功能的影響。張漢峰等人研究了蒙古族清熱八味散（額日二味散）對sd的臨床療效。然而，對于提取和測定蒙藥清熱八味散的糖含量，沒有專門的文獻(xiàn)。為了繼續(xù)開發(fā)蒙藥清熱八味散的水處理方法，這項(xiàng)工作使用了一種傳統(tǒng)的苯硫酸-石腦油法，并采用了分光光度法測定總糖含量。為了研究蒙藥清熱八味散的提取、分離和提取以及不同的提取條件，提出了評價蒙藥清熱八味散糖含量的理論依據(jù)。1材料和機(jī)器的試劑1.1材料：蒙藥清熱八味散內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，批號：20071311.2實(shí)驗(yàn)儀器FA2104電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司);722S可見分光光度計(上海精良科學(xué)儀器有限公司公司);DHG-9070電熱恒溫古風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);W2-100SP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司).乙醇、乙醚、丙酮、葡萄糖、苯酚、濃硫酸等均為分析純.實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸餾水.2方法和結(jié)果2.1灰色粗多糖的制備稱取清熱八味散樣品5.92g,放入500mL燒瓶中,加入適量蒸餾水,水浴加熱,溫度為80℃,提取3次,合并提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,加乙醇醇析,使含醇量達(dá)到80%,靜置24h,抽濾,用乙醇、丙酮、乙醚分別洗滌3次,干燥后得灰褐色粗多糖0.38g.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2.2.1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液及供試品溶液的配制(1)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的配制:精確稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖25mg,加適量水溶解,轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度并搖勻,即配成濃度為0.01mg/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,5℃冰箱儲存?zhèn)溆?(2)5%苯酚試劑的配制:稱取5.0g苯酚,加適量水溶解,轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,加蒸餾水定容,搖勻后轉(zhuǎn)移到棕色試劑瓶中,放入冰箱備用.(3)供試品溶液的配制:準(zhǔn)確稱取粗多糖50mg,加適量水溶解,轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,加蒸餾水定容,搖勻,制成0.5mg·mL-1的供試品溶液.2.2.2最大吸收波長的確定原理:硫酸-苯酚試劑可與游離的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起顯色反映,己糖在490nm(戊糖在480nm)左右處有最大吸收,吸收值與糖濃度呈線性關(guān)系.精確吸取1.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL比色管中,加入5%的苯酚溶液1.0mL,搖勻,然后加濃硫酸5.0mL,放置10min,加蒸餾水定容,充分搖勻,室溫放置30min,同時做一空白實(shí)驗(yàn),在400~600nm范圍內(nèi)用紫外分光光度計進(jìn)行全波長掃描,最后確定最大吸收波長為490nm.2.2.3線性關(guān)系的考察2,0.4,0.6,0.8,1.0mL置于五個10mL比色管中,各加入5%的苯酚溶液1.0mL,搖勻,然后加濃硫酸5.0mL,放置10min,加蒸餾水定容,充分搖勻,室溫放置30min,同時做一空白實(shí)驗(yàn),在490nm處測定吸光度,以吸光度(A)對濃度(C)線性回歸計算,得回歸方程A=23.1375C+0.0299,r=0.9992,樣品在20-100μg/mL的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系.2.3稱取5份樣品中的8種干燥藥物，按照試驗(yàn)溶液的方法制備干燥溶液，準(zhǔn)確提取0.6ml，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測定a的吸收。對于八個干分解中的糖含量，表1顯示了相應(yīng)的計算方法2.4在加標(biāo)回收率試驗(yàn)中，準(zhǔn)確測定了5個已知含量的樣品溶液，加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并以2.2.3的方式在最大吸收波長為490nm的樣品吸收中測量回收率。結(jié)果表明，回收率的平均值如表2所示。該方法顯然具有良好的回收率2.5在精密度試驗(yàn)中，正確測定了6份標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，分別為1.0ml。然后在方法2.2.3中測量最大吸收波長為490nm的吸收。因此，吸收值為sd=0.77%n.6，表明儀器的精密度良好2.6對穩(wěn)定性試驗(yàn)的精確量取0.5ml試驗(yàn)溶液，并以2.2.3的方法，在最大吸收波長為490nm的條件下分別測量吸收，并連續(xù)測量6次。吸收值a的psd=0.58%n.6，樣品溶液在出現(xiàn)后至少在3小時內(nèi)保持穩(wěn)定2.7在重復(fù)試驗(yàn)中，正確稱取5個糖樣，每10mg，加水溶解，定容至25ml。吸收率由模式2.2.3測量，最大吸收波長為490nm。因此，吸收值為sd=0.92%n.5，表明重建效果良好3蒙藥熱重八味散中多糖含量的測定(1)苯酚-硫酸法較為穩(wěn)定,而且不同的多糖和單糖顯色反應(yīng)后顯示不同的最大吸收峰,是較為理想的多糖測定方法.進(jìn)一步通過穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率等方法學(xué)實(shí)驗(yàn)說明該方法不僅準(zhǔn)確可靠,簡便快速,正確率和精密度高,而且重現(xiàn)性好,顏色穩(wěn)定,可作為蒙藥清熱八味散中多糖含量的測定方法.(2)苯酚溶液易被氧化,實(shí)驗(yàn)時應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用.(3)由于多糖的生物活性與其純度和化學(xué)結(jié)