3,5-二氟苯乙酰-l-丙氨酰-s-苯基甘氨酸-丁酯對人牙髓細胞的體外抑制作用

3,5-二氟苯乙酰-l-丙氨酰-s-苯基甘氨酸-丁酯對人牙髓細胞的體外抑制作用

信號通道與牙齒髓的遷移、殖長和分化過程密切相關。γ-分泌酶是Notch信號轉(zhuǎn)導過程中釋放Notch受體胞內(nèi)段(notchintracellulardomain,NICD)這一關鍵步驟的關鍵酶。多種研究表明應用γ-分泌酶抑制劑可有效抑制其活性,導致不能水解出NICD,阻斷其激活下游基因的表達,從而影響細胞的一系列生命活動。應用γ-分泌酶抑制劑的方法因其發(fā)展成熟、容易獲得、操作相對簡單被較多應用于Notch信號通路的研究。目前尚未見γ-分泌酶抑制劑用于人牙髓細胞的相關研究。本研究通過體外培養(yǎng)人牙髓細胞,在正常培養(yǎng)基中加入γ-分泌酶抑制劑3,5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸t(yī)-丁酯{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester),DAPT},探討DAPT對人牙髓細胞Notch信號通路是否有抑制作用,及對牙髓細胞增殖能力的影響。1數(shù)據(jù)和方法1.1試劑和試劑盒胎牛血清,高糖型DMEM培養(yǎng)基,青霉素10000U/mL,鏈霉素10000mg/L,L-谷氨酰胺200mmol/L,Ⅰ型膠原酶,0.25%(質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶-EDTA,以上均購自美國GIBCO公司;DAPT購自美Sigma公司;二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)購自美國Sigma公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazoliumbromide),MTT]粉末購自美國Amresco公司;焦炭酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)購自美國Amresco公司;TRIZOL購自美國Invitrogen公司;SuperScriptⅢFirststrand試劑盒(18080-051)購自美國Invitrogen公司;PowerSYBRGreenPCRMasterMix(4367659)購自英國AppliedBiosystems公司。1.2實驗中引用的物品引物采用PrimerPremier5.0軟件設計擴增,上海生工生物技術(shù)公司合成(表1)。1.3人牙髓細胞的培養(yǎng)本研究采用3個不同來源的人牙髓細胞獨立實驗,重復3次。人牙髓細胞來源:(1)23歲女性,因阻生拔除的左下第三磨牙;(2)22歲男性,因阻生拔除的左上第三磨牙;(3)14歲女性,因正畸減數(shù)拔除的右下第一前磨牙。以上3例均來自北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院頜面外科門診,并取得患者及家屬的知情同意。同一顆牙齒來源的牙髓細胞被分為以下3組:(1)空白組:人牙髓細胞使用正常培養(yǎng)基體外傳代培養(yǎng);(2)實驗組:正常培養(yǎng)基中加入γ-分泌酶抑制劑DAPT,終濃度為5μmol/L;(3)陰性對照組:正常培養(yǎng)基中與實驗組同步等量添加DAPT的溶劑DMSO。正常培養(yǎng)基為:高糖型DMEM培養(yǎng)基,青霉素100U/mL,鏈霉素100mg/L,L-谷氨酰胺2mmol/L,15%(體積分數(shù))胎牛血清,pH值為7.0～7.2。人牙髓細胞的原代培養(yǎng)方法同Zou等的研究方法。收集臨床上完整拔除的健康前磨牙或第三磨牙,采用酶消化法進行人牙髓細胞的原代培養(yǎng)。每次傳代為細胞長至80%～90%匯合,并按照3×105個/瓶的密度接種于新的50mL培養(yǎng)瓶,依此方法連續(xù)培養(yǎng)傳代。從第4代開始,分別于實驗組和陰性對照組同步加入等量DAPT和DMSO,隔天換新鮮培養(yǎng)液。根據(jù)人牙髓細胞體外培養(yǎng)至第15代左右時出現(xiàn)增殖停滯的特點,本研究選取第4代、第8代和第10代,共計3個時點動態(tài)觀察體外培養(yǎng)過程牙髓細胞增殖能力和Notch信號通路下游基因表達的變化。1.4逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量pcr檢測hes1基因表達水平提取第4代、第8代和第10代牙髓細胞的總RNA,采用SuperScriptⅢFirststrand試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成。利用實時熒光定量PCR反應進行Hes1基因表達水平的檢測。反應條件:50℃,2min;95℃,10min;95℃,15s,60℃,1min,40個循環(huán)。采用ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù),結(jié)果使用SPSS13.0軟件,采用t檢驗進行數(shù)據(jù)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。1.5細胞裂解液的制備按照上述方法培養(yǎng)實驗組和陰性對照組人牙髓細胞,處理至第10代,細胞匯合至80%～90%時棄培養(yǎng)液,用PBS洗滌細胞2遍,加2mLTRIZOL裂解細胞,搖勻,室溫靜置5min。用加樣器吹打均勻,迅速將細胞裂解液吸到RNasefreeDEPC處理過的1.5mLEP管中,標記實驗組和陰性對照組。在干冰條件下,將樣本運送上?？党缮锟萍加邢薰咀鯪otchSignalingPathway的RT2ProfilerPCRArray(SuperArrayBioscience公司)的分析。采用上述ΔΔCt方法計算數(shù)據(jù),比較實驗組和陰性對照組Notch信號通路相關基因的表達差異。1.6細胞增殖曲線按照上述牙髓細胞培養(yǎng)代數(shù)檢測點,于96孔培養(yǎng)板每孔中等量接種5×103個細胞,設置接種后第1、3、5、7天共4個時間點波長570nm測定細胞的D值,每個時間點設置6個復孔。以培養(yǎng)時間為橫坐標,D值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),單因素方差分析法分析不同細胞代數(shù)細胞的D值。2結(jié)果2.1實驗組細胞hes1表達量的比較加入γ-分泌酶抑制劑DAPT后,第4代實驗組人牙髓細胞中Notch信號通路下游基因Hes1的表達量比陰性對照組低,與陰性對照組的比值為0.30,經(jīng)t檢驗統(tǒng)計分析差異有統(tǒng)計學意義(t=37.538,P=0.001)。至第8代時,實驗組細胞Hes1表達量與陰性對照組的比值為0.22,差異有統(tǒng)計學意義(t=29.125,P=0.001)。至第10代時,實驗組細胞Hes1表達量降低,與陰性對照組的比值為0.20,差異有統(tǒng)計學意義(t=33.143,P=0.001,圖1)。2.2s1、東南角、陰性對照組第10代實驗組和陰性對照組牙髓細胞進一步做Notch信號通路相關基因的PCRArray芯片分析,結(jié)果顯示:(1)加入DAPT后,同為Notch信號通路下游基因的Hes1、Hey1、NR4A2基因表達明顯下降,與陰性對照組的比值分別為0.17、0.28和0.34。(2)Notch信號通路受體Notch1在實驗組細胞中的表達高于陰性對照組,是陰性對照組的2.33倍;Notch信號通路配體JAG1(即Jagged1)、JAG2(即Jagged2)在實驗組細胞中的表達也高于陰性對照組,分別是陰性對照組的2.44倍和3.45倍。(3)γ-分泌酶相關的PSEN2基因(即Presenilin2)表達差異,實驗組細胞中PSEN2的表達是陰性對照組的2.19倍(圖2)。2.3小鼠細胞中dapt檢測結(jié)果加入DAPT后,第4代人牙髓細胞的實驗組與陰性對照組的增殖曲線相近,在培養(yǎng)7d內(nèi)實驗組細胞增殖趨勢未表現(xiàn)出與陰性對照組不同,各點D值差異均無統(tǒng)計學意義。其中,接種第1天,兩組D值比較差異無統(tǒng)計學意義(t=2.076,P=0.065)。第3～7天,兩組細胞D值均逐漸增高,實驗組與陰性對照組細胞各時間點D值相近,t檢驗分析差異均無統(tǒng)計學意義,第3天,t=0.689,P=0.506;第5天,t=1.388,P=0.195;第7天,t=1.028,P=0.328。第8代陰性對照組細胞增殖較快,培養(yǎng)7d內(nèi)D值逐漸升高,而實驗組細胞增殖趨勢較平緩,明顯慢于陰性對照組細胞,各點D值差異有統(tǒng)計學意義。接種第1天,實驗組與陰性對照組D值比較,差異無統(tǒng)計學意義(t=0.680,P=0.512)。從第3天開始,實驗組細胞D值低于陰性對照組細胞D值,且兩組差值隨時間延長逐漸增大,t檢驗分析實驗組和陰性對照組各點D值,其差異均有統(tǒng)計學意義。第3天時,t=3.995,P=0.003;第5天時,t=2.887,P=0.016;到第7天時,陰性對照組細胞D值已至0.256,而實驗組細胞D值則僅為0.160,低于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.024,P=0.013)。第10代實驗組細胞和陰性對照組細胞均較緩慢地增殖,但是實驗組細胞增殖仍明顯慢于陰性對照組細胞。培養(yǎng)7d內(nèi),實驗組細胞的增殖趨勢慢于陰性對照組,各點D值差異均有統(tǒng)計學意義。其中,接種第1天,實驗組與陰性對照組D值比較,差異無統(tǒng)計學意義(t=1.197,P=0.259),從第3天開始,實驗組細胞的D值均低于陰性對照組,t檢驗分析兩者差異均有統(tǒng)計學意義。第3天時,t=3.564,P=0.005;第5天時,t=7.385,P=0.000;到第7天時,陰性對照組細胞D值已增至0.192,而實驗組細胞D值則僅為0.143,仍低于陰性對照組,t檢驗分析兩者差異有統(tǒng)計學意義(t=4.635,P=0.001)。加入DAPT后第8、10代人牙髓細胞與正常第15代細胞增殖能力的比較:從第4代細胞開始在培養(yǎng)基中加入DAPT,第4代細胞實驗組與陰性對照組比較,兩組各時間點的D值差異無統(tǒng)計學意義;至第8代,實驗組細胞D值低于陰性對照組;至第10代,實驗組細胞D值仍低于陰性對照組。將第8代實驗組、第10代實驗組與正常的第15代細胞的增殖曲線進行比較,結(jié)果表明第8代實驗組細胞增殖曲線明顯平緩,與正常第15代細胞增殖曲線極相近,幾近不增殖,第10代實驗組細胞增殖曲線疊加在正常第15代細胞增殖曲線上,三者的增殖曲線上各點D值相近,經(jīng)檢驗差異均無統(tǒng)計學意義(圖3)。第3天時,3組的D值均低于0.100水平,單因素方差分析三者差異無統(tǒng)計學意義(F=2.581,P=0.109);第5天時,F=0.132,P=0.877;培養(yǎng)至第7天時,3組細胞的D值均維持在0.200以下水平,單因素方差分析三者差異無統(tǒng)計學意義(F=2.753,P=0.096)。3兩種信號通路的聯(lián)合應用Notch信號通路是一種高度進化保守的相鄰細胞間作用途徑,其介導的細胞間相互作用的本質(zhì)在于相鄰細胞受、配體的表達不同。近年來的研究已表明在牙齒發(fā)育、牙髓損傷修復過程中也可見Notch信號通路相關基因、蛋白的表達,表明Notch信號通路可能參與牙髓細胞的遷移、增殖、分化等過程,提示Notch信號通路與牙髓組織細胞的生命過程相關。在Notch信號轉(zhuǎn)導過程中,γ-分泌酶是釋放NICD這一關鍵步驟的關鍵酶,應用γ-分泌酶抑制劑可有效抑制其活性,從而不能水解出NICD,阻斷其激活下游基因的表達。目前研究較多的γ-分泌酶抑制劑包括IL-X(cbz-IL-CHO)、三肽γ-分泌酶抑制劑(z-Leu-leu-Nle-CHO)、二苯并氮(dibenzazepine)、DAPT、Compound等。其中,DAPT可特異性地抑制γ-分泌酶的活性,其作用機制可能是DAPT特異性作用于γ-分泌酶的核心組成部分PS1蛋白的C端,搶占PS中的Notch受體結(jié)合位點和水解位點;或者與γ-分泌酶的變構(gòu)位點結(jié)合改變了γ-分泌酶的構(gòu)造,從而阻止Notch受體的轉(zhuǎn)移、解螺旋過程,阻斷γ-分泌酶的水解作用。回顧DAPT用于機體各種細胞的Notch信號通路的研究,不同研究采用的DAPT濃度不盡相同。蔡良知等用DAPT阻斷人神經(jīng)干細胞的Notch信號通路,采用的濃度僅為200nmol/L。另有研究將DAPT應用于雞胚的視網(wǎng)膜前體細胞,采用的濃度達到10μmol/L。而Li等將DAPT用于大鼠的間充質(zhì)干細胞的濃度則為50μmol/L,這可能主要是因為研究所采用的細胞類型不同造成的。Yang等2008年的研究表明DAPT的EC50(effectiveconcentration)為1～10μmol/L,綜合考慮這個濃度范圍和DAPT的溶解度、細胞毒性等問題,本研究設計使用的DAPT終濃度為5μmol/L。采用此濃度的DAPT處理體外培養(yǎng)的人牙髓細胞,在第4代細胞即表現(xiàn)出了Notch信號通路下游基因Hes1基因表達顯著下降,并在第8、10代實驗組細胞中維持較低水平,表明DAPT可有效抑制體外培養(yǎng)人牙髓細胞的Notch信號通路。從第8代開始實驗組細胞表達Notch信號通路下游基因的水平維持在陰性對照組的20%左右,而并不是全部阻斷,這與以往的研究結(jié)果一致。可能是因為Notch信號通路除了經(jīng)γ-分泌酶水解過程的經(jīng)典通路外,還存在不依賴此過程的非經(jīng)典通路,而DAPT只能阻斷經(jīng)典的Notch信號轉(zhuǎn)導通路。另外,本研究設定細胞傳代的比例是實驗組與陰性對照組按照相同細胞數(shù)量傳代接種于培養(yǎng)瓶中,這是因為Notch信號通路是相鄰細胞間作用途徑,細胞密度太低時細胞間距離大,相鄰細胞的Notch配體不能與受體結(jié)合,從而影響下游通路的作用。以相同的密度接種,可以排除細胞密度對Notch信號通路的影響,后續(xù)細胞的表現(xiàn)是DAPT作用的效果。為了全面了解阻斷人牙髓細胞Notch信號通路后,細胞中Notch信號通路相關基因表達的變化,本研究做了第10代細胞實驗組和陰性對照組的Real-timePCRArray基因芯片分析。結(jié)果表明Notch信號通路下游基因Hes1和Hey1的表達顯著下降,與實時熒光定量RT-PCR結(jié)果一致。NR4A2(nuclearreceptorsubfamily4,groupA,member2)也是一種Notch信號通路的下游基因,編碼一種轉(zhuǎn)錄因子,與核受體相關因子有關。加入DAPT后,NR4A2基因表達下降,與陰性對照組的比值為0.34,也可以作為Notch信號通路被抑制的證據(jù)之一。Notch1,Jagged1、Jagged2基因是編碼Notch受體、配體的基因,阻斷Notch信號通路后,第10代實驗組細胞的Notch1,Jagged1、Jagged2基因表達上調(diào),可能是因為Notch受體、配體與Notch信號通路的負反饋調(diào)節(jié)造成的。這與Tranasi等觀察到老年人牙髓中Notch1、Notch2基因表達下降的結(jié)果相反。分析原因,可能是因為本研究對體外培養(yǎng)人牙髓細胞的Notch信號通路進行抑制后,細胞內(nèi)Notch信號轉(zhuǎn)導受阻,細胞代償性的上調(diào)Notch受體、配體基因的表達。PSEN2基因編碼重要組成部分早老蛋白(presenilin,PS),該基因的表達上調(diào)可能是因為DAPT搶占PS中的Notch受體結(jié)合位點和水解位點或者變構(gòu)位點,抑制了PS蛋白的作用,細胞負反饋上調(diào)PS基因的表達以編碼產(chǎn)生更多的PS蛋白。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)DAPT抑制Notch信號通路的牙髓細胞增殖能力顯著下降。在第4代時,雖然Notch信號通路下游基因Hes1基因表達已顯著下降,但此時實驗組與陰性對照組細胞的增殖能力未見差異;至第8代、第10代時細胞增殖能力顯現(xiàn)差異,可能是因為基因的表達水平在抑制劑作用后短時間內(nèi)即可顯現(xiàn)差異,而細胞的增殖作為宏觀表現(xiàn),需要基因調(diào)控、蛋白表達,最后才體現(xiàn)在細胞的增殖減慢,這個過程需要時間。將第8代、第10代實驗組細胞與第15代正常傳代培養(yǎng)的細胞比較,發(fā)現(xiàn)Notch信號通路抑制后第8代細胞就相當于正常第15代細胞,細胞幾近不增殖,第10代細胞增殖曲線亦與以上兩者疊加,提示抑制Notch信號通路后,第8代細胞就已相當于正常第15代細胞,年輕代數(shù)的細胞即可在細胞水平上提前表現(xiàn)出老化的特征。Notch信號通路對細胞增殖的影響可能是因為Notch信號通路的暢通與否影響著與細胞增殖相關的下游基因的表達。以往也有研究證明DAPT阻斷Notch信號通路后,能夠抑制大鼠腦神經(jīng)干細胞的增殖。對胰腺癌細胞(BxPC-3,HPAC,PANC-1)的研究發(fā)現(xiàn),位于細胞膜上的Notch1受體表達的下調(diào)可使癌細胞增殖減慢,其中處于G0-G1期的細胞數(shù)量增加,細胞周期素A(CyclinA)和D1(CyclinD1