碳源對啤酒酵母有機酸代謝的影響

碳源對啤酒酵母有機酸代謝的影響

有機質(zhì)是啤酒中的重要化合物。母乳素的代謝是啤酒中脂肪酸的主要來源。它的組成和含量影響著啤酒的口味。啤酒酵母發(fā)酵所產(chǎn)主要有機酸為檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸和酒石酸等。在啤酒釀造過程中,雖然有機酸類物質(zhì)并不構(gòu)成啤酒的香味,但是由于有機酸本身所具有的酸味和特殊氣味,使得它對酒風味影響的重要性僅次于酯類。并且在啤酒酵母發(fā)酵過程中,有機酸的形成能逐步降低發(fā)酵液的pH值,這有助于蛋白質(zhì)凝固析出,還可抑制部分雜菌的生長繁殖;除了影響啤酒的pH值外,還影響啤酒的風味和口感。培養(yǎng)基中碳源的生理功能主要有2點:一是構(gòu)成細胞物質(zhì)和各種代謝產(chǎn)物的碳架。二是提供細胞活動所需能量。碳源經(jīng)分解代謝產(chǎn)生能量(ATP)和一系列重要的中間代謝物,供合成代謝所需。在不同糖作碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng),酵母對不同碳源底物的利用速度不同必然導致其對有機酸代謝產(chǎn)生很大影響。本文主要討論啤酒酵母在3種不同碳源培養(yǎng)下代謝有機酸的情況,應用高效液相色譜(HPLC)對不同碳源培養(yǎng)的酵母產(chǎn)酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸等動態(tài)變化進行了分析研究,以期探討啤酒酵母細胞在不同碳源條件下代謝產(chǎn)酸規(guī)律。1材料和設(shè)備1.1材料表面啤酒酵母:由大連華潤啤酒廠提供。1.2試劑酵母膏(生化試劑),葡萄糖,果糖,麥芽糖,磷酸氫二鉀,硫酸鎂,鹽酸,酒石酸鉀鈉,尿素。1.3試驗箱WFJ7200型可見光分光光度計:尤尼柯(上海)有限公司;壓力蒸汽滅菌鍋:上海第二分析儀器廠;電熱恒溫干燥箱:大連第四儀器廠;電子秤:北京光學儀器廠;高速冷凍離心機B-22M:ThermoIEC;HPS-250生化培養(yǎng)箱:哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;高效液相色譜儀:Jasco,日本。2實驗分析和檢測方法2.1鹽酸調(diào)節(jié)ph值Ⅰ葡萄糖10%,酵母膏0.5%,尿素0.1%,磷酸氫二鉀0.1%,Ⅱ果糖10%,酵母膏0.5%,尿素0.1%,磷酸氫二鉀0.1%,Ⅲ麥芽糖10%,酵母膏0.5%,尿素0.1%,磷酸氫二鉀0.1%,各用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5.4左右,定容至200mL。2.2制備鮮酵母泥上述各培養(yǎng)基在溫度121℃,壓力0.15MPa滅菌15min后冷卻備用。取新鮮酵母泥樣品在6000r/min離心5min,然后用6℃無菌去離子水反復洗滌3次后,沉淀酵母泥,在無菌條件下按0.6%(v/v)接種。好氧培養(yǎng)條件為恒溫(20+0.5)℃、轉(zhuǎn)速(150+5)r/min搖床培養(yǎng),每12h取樣檢測1次。2.3孔濾膜過濾劑及標準有機酸標準有機酸溶液采用超純水配制,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后備用。標準有機酸:酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸(色譜純);超純水:娃哈哈純凈水經(jīng)0.45μm孔徑的合成纖維素酯濾膜進行真空超濾。2.4有機酸的測定還原糖的測定:參照文獻進行。發(fā)酵液預處理:取20mL發(fā)酵液,快速于5℃18000r/min超高速冷凍離心10min。上清液留樣以測發(fā)酵液中有機酸備用。有機酸的檢測:采用高效液相色譜法(HPLC)對有機酸的測定。分離柱C18填料,Sep-PakC18(S-P柱,國產(chǎn));流動相:0.01mol/LKH2PO冰溶液,pH2.65(磷酸調(diào)節(jié))用0.45μm孔徑的合成纖維素酯濾膜進行真空超濾,超聲波脫氣30min。流速為1mL/min;監(jiān)測器波長:215nm:柱壓:100kPa;柱溫:室溫;靈敏度:0.04;進樣:20μL/次。經(jīng)上述18000r/min離心10min后的發(fā)酵液,用一次性無菌注射器(2mL)配合0.22μm的針筒式水膜過濾器直接進樣檢測。3結(jié)果與分析3.13量的變化情況啤酒酵母在培養(yǎng)基生長過程中還原糖含量的變化見附表。從附表可以看出,啤酒酵母發(fā)酵84h后,發(fā)酵液中糖分消耗殆盡,所以取84h為停止檢測時間。3.2三種碳源培養(yǎng)基中的有機反應3.2.1培養(yǎng)基中酒石酸含量的變化由圖1可知,啤酒酵母在3種碳源培養(yǎng)基中代謝酒石酸的含量有著較大的區(qū)別,但酒石酸的變化趨勢大致是一致的。發(fā)酵前期,酒石酸分解代謝快于它的合成代謝,酒石酸快速積累,36h左右酒石酸含量均達到最高值。其中果糖培養(yǎng)基中的酒石酸質(zhì)量濃度最高,約為250.18mg/L;麥芽糖培養(yǎng)基中的酒石酸質(zhì)量濃度最少,為187.36mg/L。隨著酵母在培養(yǎng)基中的生長進入對數(shù)生長期和穩(wěn)定期后,發(fā)酵液中酒石酸質(zhì)量濃度都表現(xiàn)出不同程度的下降趨勢。其中果糖培養(yǎng)基中的酒石酸下降趨勢比較明顯。在84h左右,隨著培養(yǎng)基中的還原糖逐漸減少直至為零,酵母生長基本結(jié)束。3種培養(yǎng)基中酒石酸的質(zhì)量濃度分別葡萄糖144.68mg/L果糖為129.28mg/L,麥芽糖118.62mg/L。3.2.2麥芽糖培養(yǎng)基中蘋果酸含量由圖2可知,啤酒酵母在3種碳源培養(yǎng)基中生長,蘋果酸的質(zhì)量濃度和達到最大值的時間跟碳源底物有著密切的關(guān)系。啤酒酵母在葡萄糖和果糖培養(yǎng)基中代謝蘋果酸的趨勢基本相同,發(fā)酵液中蘋果酸達到最大值的時間是在36h左右,最大值分別為179.34mg/L、162.55mg/L;在麥芽糖培養(yǎng)基中,啤酒酵母代謝蘋果酸達到最大值的時間是在48h左右,發(fā)酵液中的蘋果酸最大值為175.95mg/L。在麥芽糖培養(yǎng)基中蘋果酸達到最大值的時間要比葡萄糖、果糖培養(yǎng)基延遲12h,這是由于麥芽糖是二糖在培養(yǎng)基中首先要經(jīng)過一個水解的過程,水解后生成2個分子的單糖,然后被酵母吸收利用,這就限制了釀酒酵母的發(fā)酵速率,致使發(fā)酵液中蘋果酸達到最大值的時間推遲。在發(fā)酵液中的蘋果酸質(zhì)量濃度達到最大值后,隨著糖酵解途徑過程中的3羧酸循環(huán)中的蘋果酸脫氫酶的酶活逐漸增加,蘋果酸又被氧化成草酰乙酸重新回補進入循環(huán),同時NAD+被氧化成NADH。隨著發(fā)酵的結(jié)束,在84h左右3種培養(yǎng)基中的蘋果酸質(zhì)量濃度恒定,依次為葡萄糖培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度為76.37mg/L,果糖培養(yǎng)基中67.26mg/L,麥芽糖培養(yǎng)基中93.69mg/L。麥芽糖培養(yǎng)基中的含量最高,果糖培養(yǎng)基中的含量最少。3.2.3糖代謝糖對啤酒酵母的影響由圖3可知,啤酒酵母在3種碳源培養(yǎng)基中代謝琥珀酸的波動都比較大,出現(xiàn)多次的波峰現(xiàn)象,這表明啤酒酵母代謝琥珀酸的條件受多種因素的影響,包括發(fā)酵液的pH值、培養(yǎng)基中的底物濃度和代謝產(chǎn)物等等,這些因素造成TCA循環(huán)途徑的琥珀酸下游酶或上游酶活性變化,使得發(fā)酵液中的琥珀酸波動較大。總體來講,這3種糖對啤酒酵母代謝琥珀酸影響較小。在代謝終止時,麥芽糖培養(yǎng)基發(fā)酵液中的琥珀酸含量高,葡萄糖培養(yǎng)基中的含量最少。在發(fā)酵后期,由于酵母活力的下降,代謝水平的降低,各有機酸的含量波動較小。3.2.4培養(yǎng)基中檸檬酸含量由圖4可知,啤酒酵母在3種碳源培養(yǎng)基中代謝檸檬酸的量較少,而且動態(tài)變化大。在啤酒酵母生長代謝初期,檸檬酸有少量的積累,隨著啤酒酵母生長趨于正常,檸檬酸作為良好的經(jīng)濟性碳底物,容易被酵母重新利用,使得代謝途徑能夠順利進行下去。其中葡萄糖培養(yǎng)基和果糖培養(yǎng)基中檸檬酸含量最大值都出現(xiàn)在24h左右,但是葡萄糖培養(yǎng)基中檸檬酸積累的最高值為56.85mg/L,最終檸檬酸質(zhì)量濃度為35.77mg/L,下降幅度達到37.08%;果糖培養(yǎng)基中檸檬酸積累的最高值為49.82mg/L,最終檸檬酸質(zhì)量濃度40.59mg/L,下降幅度為18.53%。下降幅度葡萄糖培養(yǎng)基要遠高于果糖培養(yǎng)基。麥芽糖培養(yǎng)基中檸檬酸含量最大值出現(xiàn)在36h左右,質(zhì)量濃度為59.31mg/L;最終檸檬酸質(zhì)量濃度為50.39mg/L;下降幅度分別為15.04%。麥芽糖培養(yǎng)基中檸檬酸的最終質(zhì)量濃度要高于葡萄糖和果糖,這是因為在發(fā)酵后期由于單糖利用的速度要快于雙糖,致使單糖培養(yǎng)基中的檸檬酸碳底物被酵母重新攝入胞內(nèi)利用,引起檸檬酸酸含量逐步降低,所以單糖培養(yǎng)基中的檸檬酸的質(zhì)量濃度要小于雙糖培養(yǎng)基。4不同碳源培養(yǎng)基對糖代謝的影響啤酒酵母在3種糖類物質(zhì)作碳源培養(yǎng)基中生長,通過高效液相色譜(HPLC)對發(fā)酵液中酒石酸、蘋果酸、玻珀酸、檸檬酸4種有機酸含量進行檢測,可以得出以下結(jié)論:(1)啤酒酵母在葡萄糖培養(yǎng)基中生長代謝酒石酸最終質(zhì)量濃度最大,為144.68mg/L;果糖培養(yǎng)基129.28mg/L;麥芽糖培養(yǎng)基為118.62mg/L。(2)啤酒酵母在單糖培養(yǎng)基中代謝達到峰值時間要比雙糖快約12h,而最后麥芽糖培養(yǎng)基中蘋果酸的含量最高,為93.69mg/L;葡萄糖培養(yǎng)基中為76.37mg/L;果糖培養(yǎng)基中為67.26mg/L。(3)啤酒酵母在3種碳源培養(yǎng)基中代謝琥珀酸的波動幅度大,在代謝終止