肉雞全價(jià)料菌劑的制備研究

肉雞全價(jià)料菌劑的制備研究

作為食品和飼料行業(yè)的主要綠色添加劑，其抗壓、儲(chǔ)存過(guò)程和體內(nèi)功能過(guò)程的抗逆性存在著問(wèn)題，嚴(yán)重影響了貨幣價(jià)格的持續(xù)時(shí)間和使用效果。目前國(guó)內(nèi)對(duì)益生菌抗逆性的研究涉及耐高溫、耐高壓等方面,多為簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室模擬試驗(yàn),但關(guān)于工廠化制粒條件下微生物存活情況的研究并不多見,近年僅李卓佳等開展了類似的研究,該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),篩選出的芽孢桿菌經(jīng)對(duì)蝦飼料制粒工藝流程后芽孢桿菌存活95%,烘干后芽孢桿菌存活93%,證明芽孢桿菌能夠承受飼料制粒生產(chǎn)中壓力、溫度和水分的變化。至于采用工廠化制粒機(jī)將農(nóng)業(yè)部最新公布的安全菌珠添加到無(wú)抗肉雞料中進(jìn)行系統(tǒng)抗逆性的研究還未見公開報(bào)道。由于制粒溫度和壓力是影響益生菌存活的2個(gè)主要因素,本試驗(yàn)通過(guò)改變制粒過(guò)程中的溫度和壓力條件,研究益生菌在不同制粒條件下的存活情況,篩選能夠耐受制粒的菌株。并在常溫常壓下對(duì)其制劑樣品進(jìn)行保存試驗(yàn),研究保存時(shí)間對(duì)其活力的影響。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株保存培養(yǎng)地衣芽孢桿菌TS-01(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌TS-02(Bacillussubtilis)為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所飼料添加劑研究室保存菌株。干酪乳桿菌TS-04(1.29)(Lactobacilluscasei)、植物乳桿菌TS-05(1.19)(Lactobacillusplantarum)、糞鏈球菌TS-06(1.130)(Streptococcusfaecalis)、乳鏈球菌TS-08(1.2030)(Streptococcuslactis)、啤酒酵母TS-10(2.604)(Saccharomycescerevisiae)、產(chǎn)朊假絲酵母TS-11(2.281)(Candidautilis)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。1.1.2培養(yǎng)培養(yǎng)基、吸附劑和飼料營(yíng)養(yǎng)瓊脂、mrs培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂、肉濃度、蛋白粉、紹皮等1.1.3實(shí)驗(yàn)室常規(guī)器器飼料制粒機(jī)(申德520型)、生化培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療器械廠LRH-150B型、LRH-250A型)、搖床(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司HZQ-Q型)、超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體一廠)、立式自動(dòng)電熱蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠LDZX-40BI型)以及微波爐、超聲波洗滌機(jī)、振蕩器、攪拌機(jī)、粉碎機(jī)、電子天平、干燥箱及其他實(shí)驗(yàn)室常規(guī)器皿。1.2方法1.2.1菌劑的制備菌株接種于發(fā)酵液中,于各自最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng),將發(fā)酵液按1∶1比例與滅菌麩皮混合,并在混合機(jī)上混勻,干燥,用40目篩在粉碎機(jī)上粉碎,制得菌劑。1.2.2菌液的配制及培養(yǎng)菌稀釋液制備:分別取菌劑1g溶于9mL無(wú)菌水中,混勻,取1mL該懸浮液加入到盛9mL無(wú)菌水的試管中,混勻,再?gòu)膭倓偦靹虻木褐腥?mL,加入到另一個(gè)盛有9mL無(wú)菌水的試管中,重復(fù)同樣操作,酌情對(duì)菌液進(jìn)行稀釋。選取3個(gè)梯度的菌液,分別取0.2mL加入培養(yǎng)皿中,每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)。瓊脂平板的制備:將營(yíng)養(yǎng)瓊脂溶于盛有250mL蒸餾水錐形瓶中(每3.3g瓊脂加100mL蒸餾水)滅菌,取出后等瓊脂溫度冷卻到50℃左右,迅速將其逐個(gè)倒入培養(yǎng)皿中,輕輕搖勻。瓊脂量一般以能全部覆蓋平皿底部為宜。培養(yǎng):將冷卻凝固的平皿倒置,放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36~48h,培養(yǎng)溫度為37℃。菌落計(jì)數(shù):取出培養(yǎng)好的平皿,選取菌落在30~300個(gè)之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)。菌數(shù):菌劑活菌含量(個(gè)/g菌劑)=平皿上菌落數(shù)×5×稀釋度。1.2.3菌劑裝加量及飼料0.1%的添加量將活菌劑分裝,飼料廠制粒機(jī)每次的出料量為1.6t,故每種菌劑的添加量為1.6kg。每種菌劑裝3個(gè)重復(fù),對(duì)應(yīng)3種不同的制粒條件,分別設(shè)為A(0.1Mpa,65℃)、B(0.2Mpa,70℃)、C(0.3Mpa,75℃),制粒飼料為華都肉雞公司無(wú)抗肉雞料(42~49日齡)。取樣后用1.2.2進(jìn)行活菌含量檢測(cè)。1.2.4受制粒過(guò)程的益生菌對(duì)上述顆粒料中活菌進(jìn)行檢測(cè),篩選出耐受制粒過(guò)程的益生菌株。之后對(duì)它們進(jìn)行常溫常壓密封保存試驗(yàn),每隔半個(gè)月檢測(cè)1次活菌含量,共持續(xù)3個(gè)月。2結(jié)果2.1ts-10在a、b、c條件下的死亡率由表1、2可以看出,TS-01、TS-02在3種制粒條件下,活菌含量與制粒前相比,死亡率很低,TS-01為2.69%、3.85%、8.85%,TS-02為0%、3.50%、5.00%;TS-08在A和B條件下,死亡率分別為26.2%、25.4%,在C條件下,死亡率達(dá)91.5%;TS-10在A、B、C死亡率分別為8.95%、18.2%、36.1%;TS-04、TS-05、TS-06、TS-11在A、B、C死亡率均非常高。2.2儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)抗凝劑活性的影響3討論3.1細(xì)菌熱管理系統(tǒng)intet乳鏈球菌和啤酒酵母在制粒過(guò)程中活菌的變化不大,制粒后其死亡率比較低,它們抗逆性比較強(qiáng)的原因可能與菌株自身特性有關(guān)。Melchior認(rèn)為耐熱細(xì)菌的細(xì)胞膜具有特殊的組成,一般含有異型脂肪酸、穩(wěn)定型脂肪酸和環(huán)烷型脂肪酸,而無(wú)不穩(wěn)定的不飽和脂肪酸。增加磷脂酰烷基鏈的長(zhǎng)度,增加異構(gòu)化支鏈比率,或增加脂肪酸飽和度,均可以維持細(xì)胞膜的整齊狀態(tài)———液晶態(tài)。細(xì)菌耐熱的另一個(gè)可能機(jī)制是其蛋白質(zhì)具有熱穩(wěn)定性,Rainer認(rèn)為細(xì)菌耐熱可能與構(gòu)成蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的非共價(jià)力、結(jié)構(gòu)域的包裝、亞基與輔基的聚集,以及糖基化作用、磷酸化作用有關(guān);Milo等發(fā)現(xiàn)喜熱嗜油芽孢桿菌中的兒茶酚2,3-雙加氧酶是不穩(wěn)定的,但這種酶在高溫條件下卻維持較高的活力。因此他認(rèn)為耐熱菌耐熱可能與細(xì)菌本身酶系統(tǒng)迅速更新,從而維持細(xì)菌酶正常功能有關(guān)。Hollien等認(rèn)為細(xì)菌耐熱可能與細(xì)胞膜蛋白質(zhì)個(gè)別氨基酸改變引起細(xì)胞膜疏水作用和離子間相互作用的增加有關(guān)。對(duì)于其他4株益生菌,由試驗(yàn)結(jié)果可以清楚地看出,制粒對(duì)它們的影響很大,死亡率較高,且隨著溫度和壓力的升高,活菌含量明顯下降,死亡率顯著提高,表現(xiàn)出菌體抗逆性差的特點(diǎn),說(shuō)明該4株菌不適合制粒。3.2活菌含量隨時(shí)間的變化情況有本試驗(yàn)保存條件與實(shí)際生產(chǎn)中的條件相符,選用常溫常壓。對(duì)能夠適應(yīng)制粒條件的4株菌進(jìn)行保存試驗(yàn),由試驗(yàn)結(jié)果可以看出,地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在3個(gè)月的保存期內(nèi),活菌含量幾乎保持不變,這與它們形成芽孢,極大提高它們的抗逆性有關(guān);啤酒酵母的活菌含量隨著時(shí)間的推移保持較高水平,這可能與該菌細(xì)胞壁堅(jiān)固的葡聚糖結(jié)構(gòu)有關(guān);乳鏈球菌隨著時(shí)間的推移,活菌含量逐步下降,到45d時(shí),活菌含量下降幅度增大,到75d以后趨于平緩,開始階段活菌含量下降相對(duì)較慢,這可能與活菌剛剛脫離營(yíng)養(yǎng)環(huán)境,菌體本身有一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)備,能夠抵抗短暫的非營(yíng)養(yǎng)環(huán)境有關(guān),但菌體本身的代謝能力和活力在逐步下降,到45d多數(shù)菌體本身儲(chǔ)備消耗殆盡,抵抗力迅速下降,并喪失代謝能力。在保存過(guò)程中,由于部分菌體適應(yīng)了保存環(huán)境,可以持續(xù)存活下去,因此在75d以后出現(xiàn)菌體死亡率趨于平穩(wěn)的現(xiàn)象。4芽孢桿菌的致病性地衣芽孢桿菌TS-01和枯草芽孢桿菌TS-02可以耐受制粒條件,并且在保存試驗(yàn)中活力非常穩(wěn)定,活菌損失極少;啤酒酵母活菌在制粒和保存試驗(yàn)中均體現(xiàn)出比較好的穩(wěn)定性,活菌損失比較少;上述3株菌能夠抵抗制粒條件,且在3個(gè)月的保存時(shí)間內(nèi)仍保持高的活菌含量,為本試驗(yàn)篩選出的優(yōu)良抗逆性菌株。飼料為北京華都肉雞公司的無(wú)抗生素肉雞料。由表3可以看出,TS-01、TS-02、TS-10在90d保存期內(nèi)活菌死亡率分別為2.40%、1.50%、3.50%。TS-08在第1~5天活菌死亡率為2.0%,在第45~75天之間活菌數(shù)迅速下降,達(dá)93.7%,在第75~90天之間活菌死亡率仍為93.7%。由表1和表2可以看出,地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在與飼料混合制粒后,活力幾乎沒(méi)有發(fā)生變化,可能由于這2株菌在加工成菌劑過(guò)程中,逐漸失去了溫度、營(yíng)養(yǎng)和水分的供應(yīng),使菌株逐步形成芽孢,在混合制粒過(guò)程中,芽孢菌在制粒機(jī)中停留時(shí)間大約為3~5min,溫度不足100℃,而一般認(rèn)為殺滅芽孢需121℃條件下,持續(xù)15~20min,顯然制粒溫度和時(shí)間很難對(duì)芽孢菌產(chǎn)生影響。關(guān)于芽孢菌能夠耐熱的機(jī)制現(xiàn)在尚無(wú)統(tǒng)一說(shuō)法,其中滲透調(diào)節(jié)皮層膨脹學(xué)說(shuō)具有一定的代表性,該學(xué)說(shuō)認(rèn)為,芽