NGS測序技術(shù)與分析流程圖

第一代測序技術(shù)Sanger測序1977年，桑格測定了第一個基因組序列，是噬菌體X174的，全長5375個堿基精品課件Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)，在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列精品課件新一代測序介紹三大測序平臺的前世今生LynxMPSSSolexaABISOLiD454IonTorrentHelicosSMRTIlluminaSolexaRoche454PolonySeqABIIonTorrentPacificBiosciences精品課件Roche-454454公司可謂新一代測序技術(shù)的奠基人。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)——GenomeSequencer20System，被《Nature》雜志以里程碑事件報道，開創(chuàng)了邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454公司被羅氏診斷公司以1.55億美元收購。454測序原理精品課件測序?qū)嶒灹鞒蹋?、文庫制備：根據(jù)樣品的種類和實驗?zāi)康?，將基因組DNA/cDNA片段化處理至400-800bp間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA（sstDNA）；然后和兩個44個堿基長的銜接子（adaptor）A、B進行平端連接。A、B銜接子各自含有20個堿基的PCR引物序列、20個堿基的測序引物序列和4個堿基的對照序列（TACG），除此之外，B銜接子的5’端還標記有一個生物素基團，供后續(xù)的分離合適的測序模板使用。精品課件測序?qū)嶒灹鞒蹋?、Emulsion

PCR：特定比例的單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計的DNA捕獲磁珠上，使大部分磁珠磁珠攜帶了一個獨特的單鏈DNA片斷。磁珠結(jié)合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個獨特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進行獨立的擴增，而不受其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。擴增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增后仍結(jié)合在磁珠上的片段既可被回收純化用于后續(xù)的測序?qū)嶒灒痪氛n件測序?qū)嶒灹鞒蹋?、測序反應(yīng)：攜帶DNA的珠子與其他反應(yīng)物混合物，隨后放入PTP板中進行后繼的測序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個珠子（20um）。然后將PTP板放置在GSFLX中，測序開始。每一個與模板鏈互補的核苷酸的添加都會產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的信號，并被CCD照相機所捕獲；精品課件測序?qū)嶒灹鞒蹋?、數(shù)據(jù)分析：GSFLX系統(tǒng)在10小時的運行當(dāng)中可獲得100多萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息，通過GSFLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進行分析。精品課件454Pyrosequencing精品課件精品課件454的特點與主要應(yīng)用讀長較長，400－600bp通量較低，1Run1M序列，400－600Mb相對成本較高主要應(yīng)用：denovo測序精品課件Illuminasolexa

Solexa測序原理精品課件Illuminasolexa

精品課件IlluminaSolexa橋式PCRdioldiol 1stcycledenaturation1stcycleannealingdioldioln=35total1stcycleextensiondioldioldioldiol2ndcycledenaturation2ndcycleannealingdioldioldioldioldioldiol2ndcycleextension精品課件IlluminaSolexaBaseCalling123789456TTTTTTT

G

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C

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T…精品課件Solexa的特點與主要應(yīng)用讀長較短，100－150bp通量高，25G每天，120-150G每Run主要應(yīng)用：RNA測序、表觀遺傳學(xué)研究精品課件ABI

SOLiDSOLiD

SequencingbyOligoLigation/DetectionOligo連接測序：通過連接酶連接，再對oligo上熒光基團進行檢測SOLiD5500xl精品課件ABISOLiD測序前期制備A樣品片段化磁珠連接B乳化PCR3‘末端修飾C磁珠富集轉(zhuǎn)到測序玻片精品課件ABISOLiD測序原理精品課件ABISOLiD熒光結(jié)合和結(jié)果示例@SRR029969.1VAB_5551_12_381_F3length=35T11.0203.3.1113211010332111302330201+SRR029969.1VAB_5551_12_381_F3length=35!36!8/8:!:!462>@6=(<8>8.<;2:*9748078@SRR029969.2VAB_5551_13_468_F3length=35T202312302.3333130131131322113203131+SRR029969.2VAB_5551_13_468_F3length=35!9),4/3)&$!(&(573(96,'7&91>)43),(95,A.SOLiDOligo熒光基團模式圖B.SOLiD測序結(jié)果示例（ColorSpace)精品課件精品課件SOLiD的特點與主要應(yīng)用讀長較短，50-75bp精度高，可達Q40通量高，20-30G每天，1Run可達120G主要應(yīng)用：基因組重測序、SNP檢測等精品課件IontorrentIonTorrent測序原理精品課件精度Examples: ??90% con?dence (10% error rate) = Q10 ??99% con?dence (1% error rate) = Q20 ??99.9% con?dence (.1% error rate) = Q30 精品課件三種平臺的技術(shù)差異平臺454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR橋式PCR磁珠乳化PCR測序載體磁珠玻片玻片測序方式焦磷酸、熒光可逆終止物、熒光連接酶、熒光結(jié)果序列FastQFastQCSFastQ精品課件三種平臺的效能參數(shù)差異平臺讀長通量周期精度SolexaHiSeq2000Single-end:1x35bpPaired-end:2x50bpPaired-end:2x100bp25Gb/d~1.5d~4d~8d?50bp85%以上Q30

?100bp80%以上Q30SOLiD5500xlSingle-end:75bpPaired-end:75x35bpMate-pair:60x60bp20–30Gb/d1d/1lane7d/12lane7d/12laneQ40454GSFLX400-600bp400–600Mb/Run10hQ20精品課件轉(zhuǎn)錄組測序測序流程全轉(zhuǎn)錄組總RNApolyT富集mRNA去除rRNANon-codingRNA轉(zhuǎn)錄組mRNARNA片段化、純化、檢測產(chǎn)量連接兩端接頭序列逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA選擇適當(dāng)長度cDNA進行擴增純化擴增產(chǎn)物，評估產(chǎn)量上機進行高通量測序精品課件轉(zhuǎn)錄組主要分析內(nèi)容無參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容有參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容1測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計，數(shù)據(jù)成分和質(zhì)量評估；2Contig及Scaffold長度分布3Unigene的長度分布和功能注釋，GO分類，Pathway分析，差異表達分析4蛋白功能預(yù)測與分類，差異表達基因GO富集和Pathway富集分析。1基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計，比對參考序列2序列在基因組上在分布3測序深度分析、隨機性評估和基因差異表達分析4新基因預(yù)測，基因可變剪接鑒定和基因融合鑒定等。精品課件小RNA測序精品課件果蠅三種組織中MiRNA表達情況精品課件MiRNA表達模式分析精品課件新miRNA預(yù)測精品課件miRNA編輯情況分析與統(tǒng)計精品課件分析軟件介紹質(zhì)量控制軟件(QualityControl)定位軟件(Mappingthereads)已知基因（差異）表達評估軟件(DifferentialExpression)新基因鑒定軟件(Newgeneidentification)可視化展示軟件(Virsulization)基因功能注釋軟件(GOtermorKEGGpathwayanalysis)精品課件數(shù)據(jù)格式示例Fastq格式ColorSpace格式精品課件Ph