水環(huán)境衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢測-細(xì)菌菌落總數(shù)的測定

細(xì)菌菌落總數(shù)的測定教學(xué)內(nèi)容1.細(xì)菌總數(shù)是水質(zhì)污染的重要指標(biāo)；2.稀釋平板培養(yǎng)法；3.檢測各環(huán)節(jié)操作規(guī)范。教學(xué)目標(biāo)（1）知識目標(biāo)水質(zhì)污染與細(xì)菌總數(shù)的關(guān)系；平板培養(yǎng)計數(shù)原理；樣品稀釋的方法；平板制作與培養(yǎng)方法計數(shù)與報告方式。（2）技能目標(biāo)掌握樣品稀釋的操作方法；熟練進(jìn)行無菌操作；規(guī)范制作平板；能正確控制培養(yǎng)條件；能正確計數(shù)與報告。（3）素質(zhì)態(tài)度要求

態(tài)度端正，積極主動學(xué)習(xí)，嚴(yán)守操作規(guī)范，團(tuán)結(jié)協(xié)作。一、細(xì)菌總數(shù)是水質(zhì)污染的重要指標(biāo)細(xì)菌數(shù)量與污染程度間具有相關(guān)性。水體污染主要涉及生活污水、人畜糞便、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)污染、工業(yè)污染等，污染物質(zhì)中除去部分工業(yè)污染物外大多利于細(xì)菌的生長。污染物質(zhì)的直接檢測有較大的困難，而細(xì)菌檢測相對容易，因此常用細(xì)菌數(shù)量作為水質(zhì)狀況的主要指標(biāo)之一。對于不利于細(xì)菌生長的污染物，常需檢測對應(yīng)專門微生物及污染物含量的直接檢測。二、稀釋平板培養(yǎng)計數(shù)法細(xì)菌的個體微小，直接觀察、計數(shù)困難；單個細(xì)菌經(jīng)過培養(yǎng)可長成肉眼可見的菌落；要設(shè)法避免多個細(xì)菌長成1個菌落，常需對樣品進(jìn)行稀釋處理。稀釋平板培養(yǎng)菌落1.測定的程序：樣品稀釋接種平板培養(yǎng)菌落計數(shù)報告2.材料準(zhǔn)備：培養(yǎng)皿、試管、移液管、錐形瓶等玻璃器皿的滅菌；制作營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂15g，水1000mL；pH7.4~7.6，121℃滅菌15min。制備無菌水。3.無菌操作（1）

保證除樣品外所有需使用的材料無菌（2）

無菌操作環(huán)境

凈化工作臺：紫外燈提前開放0.5h以上，放入樣品與材料需70%酒精表面消毒

開放空間：減小空氣流通（閉窗、減少人員走動等）；噴灑70%酒精凈化空間；在酒精燈火焰上方無菌區(qū)操作（高度以不燙手為宜）凈化工作臺酒精燈無菌區(qū)操作（3）

無菌操作規(guī)范

試管、錐形瓶等無菌用具在無菌區(qū)打開，在此范圍外必需封閉（基本原則），在無菌區(qū)外污染后不得再次使用；

接種工具、涂抹棒等滅菌后即時在無菌區(qū)使用，區(qū)外污染后需再滅菌使用（注意滅菌后需在無菌區(qū)冷卻后使用，以免燙死微生物而取不到到活的微生物）。

1.分裝無菌水

取數(shù)支無菌試管，標(biāo)記10－1、10－2、……,每試管分裝9ml無菌水或無菌生理鹽水。

（也可分裝好后再滅菌）

稀釋所需的數(shù)量級根據(jù)樣品中微生物量的估計而定，一般輕度污染水稀釋到10－3，重度污染水可稀釋到10－5、10－6。三、樣品的稀釋主要針對樣品中含較多微生物的水樣（水源水、污水）；自來水、飲用水一般不需稀釋，可直接取樣培養(yǎng)。2.梯次稀釋

取混勻水樣1ml放入標(biāo)記10－1試管中，充分振蕩混勻，得10－1稀釋液；

取10－1稀釋液1ml放入標(biāo)記10－2試管中，充分振蕩混勻，得10－2稀釋液；

……，依次稀釋到所需稀釋濃度。3.注意事項(xiàng)

取液量保證準(zhǔn)確；

稀釋樣要充分混勻；

保證無菌操作（防止外源污染），但加樣時注意不要太近火焰（殺死其中微生物）。混勻器1.培養(yǎng)數(shù)量

不稀釋樣：樣品、無菌水（無菌對照），共2個培養(yǎng)，每個培養(yǎng)需培養(yǎng)3個平板（重復(fù)）；

需稀釋樣：最大稀釋樣及前兩個稀釋樣、無菌水，共4個培養(yǎng)，每個培養(yǎng)需培養(yǎng)3個平板（重復(fù)）；預(yù)先在培養(yǎng)皿底面標(biāo)記清楚培養(yǎng)稀釋度、操作人、時間等信息。四、接種培養(yǎng)培養(yǎng)皿標(biāo)記2.接種平板2.1混合平板法

取各稀釋樣（無菌水）1ml放入無菌培養(yǎng)皿中，3個重復(fù)（可在稀釋的操作同時?。?/p>

倒入適溫培養(yǎng)基（50℃左右，冷卻到不燙手為宜），每皿培養(yǎng)基倒入量一般9cm培養(yǎng)皿15ml左右（培養(yǎng)皿平放時倒入一半至2/3面積左右）；

混勻（倒培養(yǎng)基時培養(yǎng)皿適度傾斜，桌面適度旋轉(zhuǎn)，但不得使培養(yǎng)基附著到培養(yǎng)皿側(cè)面）；

靜置冷卻成平板，翻轉(zhuǎn)放置。2.2平板涂布法

先制作平板；

取樣品（無菌水）0.1ml放入平板上，涂抹棒均勻涂抹平板表面，直至無殘存樣品（無菌水）；

翻轉(zhuǎn)放置。平板涂布2.3注意事項(xiàng)

保證無菌操作要求，同時注意不得影響樣品中的微生物（培養(yǎng)基不得太燙，取樣時不要離火焰太近）；

制作平板時培養(yǎng)基不得沾附底面之外的側(cè)面甚至蓋上，未凝固前不得翻轉(zhuǎn)；

不同稀釋度不得使用同一移液管，防止交叉影響及污染；

平板涂布法中，最好先在凈化工作臺中提前制作平板，并放置一段時間（2d左右），以使表面稍干燥便于涂布。3.培養(yǎng)

培養(yǎng)溫度為36℃，培養(yǎng)時間24h；選用普通電熱恒溫培養(yǎng)箱，也可選用生化培養(yǎng)箱或霉菌培養(yǎng)箱；

平板培養(yǎng)基一面朝上，不可顛倒；

根據(jù)培養(yǎng)時間要求及時取出進(jìn)行后續(xù)處理。1.菌落計數(shù)方法

觀察方法：直接肉眼觀察計數(shù)，必要時用放大鏡、菌落計數(shù)儀觀察，防止遺漏。

特殊情況的處理：

若某平板有較大片狀菌落生長且超過一半面積時，此平板則不宜作計數(shù)用；

片狀菌落小于一半面積，且其余菌落分布又很均勻時，可取平板一半面積計菌落數(shù)，再乘以2得本平板菌落數(shù)。五、菌落計數(shù)與報告2.不同稀釋度的

選擇與報告3.報告方式

菌落數(shù)在100以內(nèi)，按實(shí)際數(shù)據(jù)報告；

大于100時，采用2位有效數(shù)字，在有效數(shù)字后的位數(shù)，以四舍五入方法計算；

數(shù)值較大時，數(shù)字后可用10的指數(shù)表示。四、任務(wù)考核考核內(nèi)容考核指標(biāo)分值總體操作程序是否清楚、規(guī)范15材料準(zhǔn)備及器皿標(biāo)記材料準(zhǔn)備種類、數(shù)量，培養(yǎng)皿、試