微生物生理-微生物的生長與繁殖

測定微生物總數(shù)主要內容顯微鏡直接計數(shù)法

光電比濁計數(shù)法顯微鏡直接計數(shù)法顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。直接計數(shù)法優(yōu)缺點優(yōu)點：直觀、快速、操作簡單。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)；不適于對運動細菌的計數(shù)。顯微鏡直接計數(shù)法常用計數(shù)器有血球計數(shù)板(血細胞計數(shù)板)、Petroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等。各種計數(shù)板的計數(shù)原理相同，只是血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡觀察，只能計數(shù)較大的霉菌孢子和酵母菌；而后兩種計菌器細菌，可以使用油鏡觀察，因此可以直接計數(shù)細菌。顯微鏡直接計數(shù)法

血球計數(shù)板

Petroff-Hauser計菌器Hawksley計菌器顯微鏡直接計數(shù)法血球計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網(wǎng)。顯微鏡直接計數(shù)法每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格：一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格。顯微鏡直接計數(shù)法計數(shù)方法使用血球計數(shù)板計數(shù)時，通常數(shù)5個中方格的總菌數(shù)A，然后求每個中方格的平均值，再乘上大方格（計數(shù)室）中方格的數(shù)量，就得出一個大方格中的總菌數(shù)。數(shù)兩個大方格總菌數(shù)，平均后，再換算成每毫升菌液中微生物細胞的數(shù)量。光電比濁計數(shù)法基本原理：當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定范圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測定光密度，作出光密度-菌數(shù)標準曲線。然后，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線中查出對應的菌數(shù)。比濁法的優(yōu)缺點優(yōu)點：簡便、快速、連續(xù)測定、適合自動化。缺點：光密度受細胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分

以及選用的波長的影響；對于不同微生物的菌懸液要選擇相應的

菌株和培養(yǎng)條件制作標準曲線；對于顏色太深的樣品或含其它具有吸光

值的物質不能用此法。比濁法的操作步驟標準曲線的制作1、血球計數(shù)板直接計數(shù)：首先采用血球計數(shù)直接計數(shù)釀酒酵母菌懸液。2、稀釋菌液：將上述已知濃度的釀酒酵母菌懸液用無菌生理鹽水進行兩倍梯度稀釋，共稀釋6個濃度。3、測OD值：以無菌生理鹽水作為對照，于波長560nm處用1cm比色杯測定上述各菌液的OD值。4、以OD值為縱坐標，每毫升菌數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。比濁法的操作步驟樣品的測定1、稀釋樣品：將待測菌懸液用無菌生理鹽水適當稀釋。2、在560nm波長用1cm比色皿測定稀釋后菌懸液的光密度。3、計算：根據(jù)所測得的光密度值，從標準曲線查得每毫升的含菌數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)就得到原液中細菌數(shù)。小結

1)顯微鏡直接計數(shù)法：直觀、快速、易操作；不能區(qū)分死菌和活菌，也不適于運動細菌的計數(shù)；

2)光電比濁計數(shù)法：簡便、快速適合連續(xù)自動化；影響光密度的因素較多，對標準曲線的制作要求較高，對于顏色太深或含其它具有吸光值物質的樣品不能用此法。測定活菌數(shù)和生長量主要內容1活菌數(shù)測定法2測定微生物生長量

1活菌數(shù)測定法1.1平板菌落計數(shù)法1.2液體稀釋測定法1.3膜過濾計數(shù)法1.1平板活菌計數(shù)法b.稀釋倒平板法操作較麻煩，對好氧菌、熱敏感菌效果不好！a.涂布平板法使用較多的常規(guī)方法，但有時涂布不均勻！1.2液體稀釋測定法

測定不占優(yōu)勢，但具有某種特殊生理功能的類群。X5X5X5X5

稀釋度

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

重復數(shù)

5

5

5

5

5

5

出現(xiàn)生長的管數(shù)

5

5

5

3

1

01.3膜過濾計數(shù)法硝酸纖維素膜測定空氣、水等含菌量低的樣品當中的活菌數(shù)2測定微生物生長量2.1重量測定法2.2細胞組分含量測定法2.3菌絲長度測定法2.4生理指標測定法2.1重量測定法

將一定體積樣品中的菌體通過離心或過濾的方法分離出來，用水洗凈附在細胞表面的殘留培養(yǎng)基，再次離心后直接稱重，即為濕重。

若將濕重樣品在105℃烘干或真空下干燥至恒重，即為干重。微生物的干重一般為其濕重的10%～20%。干重法直接而又可靠，但要求被測菌體濃度較高，樣品中不含或少含不溶性雜質。2.2細胞組分含量測定法2.2.1蛋白質含量測定法

蛋白質是微生物細胞的主要成分，含量也比較穩(wěn)定，蛋白質含量可反映微生物的生長量。氮是蛋白質的重要組成元素，從一定體積的樣品中分離細胞，洗滌后，用凱氏定氮法或雙縮脲法測出含氮量。蛋白質含氮量為16％，因此，總含氮量與細胞蛋白質總量的關系可按下式計算：

蛋白質總量＝含氮量×6.252.2細胞組分含量測定法2.2.2DNA含量測定法DNA是微生物的重要遺傳物質，其含量較為恒定，不易受菌齡和環(huán)境因素的影響。該方法是基于DNA與3，5-二氨基苯甲酸-鹽酸結合能顯示特殊熒光的原理，定量測定菌懸液中的熒光強度，求得DNA含量。每個細菌細胞DNA平均含量為8.4×10-11mg，可根據(jù)DNA含量計算出細菌的數(shù)量。2.3菌絲長度測定法

絲狀微生物的生長可用一定時間內其菌絲的生長長度來表示。

測定方法是將絲狀真菌接種到固體培養(yǎng)基上，定時測定菌絲伸展的長度或面積。對于生長快的菌類每24h測定1次，對于生長慢的菌類可數(shù)天測定1次。該法的缺點是不能反映菌絲的縱向生長，即菌落的厚度和生長到培養(yǎng)基內部的菌絲生長，并且接種量也會影響測定結果。2.4生理指標測定法

通過測定細胞的生理指標來測定微生物生長量，與微生物生長量相平行的生理指標有耗氧量、呼吸強度、酶活性、生物熱等。根據(jù)微生物在生長過程中伴隨出現(xiàn)的這些指標，樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標愈明顯，因此可以借助特定的儀器，如瓦勃