蛋白多肽類藥物和單抗藥物免疫原性評價方法及研究進展

蛋白多肽類藥品和單抗藥品免疫原性評價辦法及研究進展作者｜王慧敏，聞鎳，王曉霞，劉麗，劉會芳內(nèi)容來源｜中國醫(yī)藥生物技術(shù).06免疫原性是指藥品刺激機體產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞的性質(zhì)[1]。許多生物藥品在體內(nèi)都含有免疫原性，對動物或人予以蛋白多肽類藥品或單克隆抗體（簡稱單抗）藥品后可能會引發(fā)機體產(chǎn)生抗藥品抗體（anti-drugantibody，ADA）。ADA會對藥品暴露、藥品代謝動力學(xué)特性、藥效、藥品毒性作用等造成影響，重要涉及：ADA與藥品結(jié)合，可能增加或減少藥品的去除、影響血漿半衰期和組織分布、變化藥品的暴露水平和藥代動力學(xué)特性ADA減少藥品暴露水平可能使非臨床毒理研究中藥品毒性作用被部分掩蓋，影響對藥品毒性作用的評價及對臨床研究中起始劑量的評定；中和抗體（neutralizingantibody，NAb）會中和藥品的活性，減少藥品的藥效作用；ADA與藥品及內(nèi)源性同系蛋白結(jié)合后，可能會造成該蛋白缺點綜合征，起對應(yīng)毒性作用；對藥品的免疫應(yīng)答可能會造成過敏反映、本身免疫等，ADA-藥品免疫復(fù)合物沉積可能引發(fā)免疫病理變化和有關(guān)不良反映。因此，在非臨床藥代動力學(xué)、藥理和毒理研究中評價免疫原性有助于對研究成果作出更加合理的解釋，是生物藥申報臨床實驗的重要內(nèi)容。同樣，免疫原性評價也是蛋白多肽類藥品和單抗藥品臨床研究中重要的評價項目，是監(jiān)管部門關(guān)注的重要內(nèi)容。在生物類似藥品研發(fā)中，也是進行相似性比對的重要指標(biāo)之一。EMA、FDA、NMPA有關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則中都規(guī)定檢測這類藥品的免疫原性，檢測的規(guī)定越來越嚴(yán)。蛋白多肽類和單抗藥品免疫原性評價重要涉及鑒定ADA的存在與否、ADA水平（抗體滴度）、與否含有中和能力、抗體產(chǎn)生比例和發(fā)展變化狀況等。有多個辦法和技術(shù)可用于ADA檢測。蛋白多肽類和單抗藥品由于給藥劑量大、半衰期長，循環(huán)中的高濃度藥品給免疫原性的評定帶來了很大挑戰(zhàn)。另外，可溶性靶標(biāo)的存在也會給單抗藥品免疫原性檢測帶來較大干擾。如何減少這些干擾，確保檢測成果的精確性、敏捷度、特異性和可靠性是現(xiàn)在ADA和NAb檢測辦法亟需解決的問題。本文對慣用的ADA和NAb檢測辦法、檢測中存在的問題、已有解決辦法及其研究進展進行綜述，為蛋白多肽類藥品和單抗藥品研究開發(fā)和應(yīng)用中免疫原性的評價提供辦法參考。1ADA的檢測ADA的檢測和表征常采用多層次辦法。檢測普通涉及篩選實驗和特異性確證明驗；表征實驗普通涉及抗體滴度測定、亞型測定和中和抗體檢測。凍干制劑核心技術(shù):處方工藝研究、工藝放大與驗證及案例分析ADA檢測實驗需要兩個核心的決策參數(shù)，分別為篩選臨界點和特異性臨界點[2]。篩選臨界點即篩選實驗中判斷樣品為陰性或陽性的響應(yīng)水平[3]，等于或高于篩選臨界點的樣品為陽性樣品。相反地，若低于篩選臨界點，則判斷該樣品為陰性樣品。一種有效的篩選臨界點需要在預(yù)研究驗證階段對一系列樣品測定值進行系統(tǒng)性的統(tǒng)計分析，然后才干擬定。普通狀況下，一定比例的假陽性成果比沒有假陽性成果好，能夠允許約5%的篩選實驗陽性成果為假陽性，以確保能夠檢測出弱陽性樣品。同時，規(guī)定所使用的樣品可代表使用目的群體或受試者。特異性臨界點是能夠區(qū)別抗藥抗體與藥品與否特異性結(jié)合的值，其有效性非常核心，必須客觀評定。不建議使用50%信號克制等主觀原則，信號略高于臨界點的抗藥抗體弱陽性樣品的評價尤為重要?？顾幙贵w的表征實驗中抗體滴度的測定，普通表達為，能夠產(chǎn)生陽性成果的最低濃度，或者說最大稀釋倍數(shù)；亞型測定即檢測抗藥抗體所屬IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM中的哪一種亞型；中和抗體的檢測即為檢測ADA中與否有能夠中和藥品活性的抗體。1.1ADA檢測分析辦法1.1.1ADA檢測慣用分析辦法慣用辦法涉及酶聯(lián)免疫法（ELISA）、放射免疫沉淀法（RIPA）、表面等離子體共振法（SPR）、電化學(xué)發(fā)光法（ECL）、全自動納升級免疫分析工作站（Gyrolab）等。免疫原性篩選普通使用操作方便快捷、能夠高通量測定的ELISA辦法。橋式ELISA辦法最為慣用，該辦法是運用包被在酶標(biāo)板上的抗體藥品捕獲血清樣品中的ADA，然后加入生物素標(biāo)記的抗體藥品，使其與ADA結(jié)合。接著用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)試劑作為檢測試劑，加入酶反映底物顯色后，再運用酶標(biāo)儀進行檢測。此法的優(yōu)點是能檢測各類抗體的亞型，可高通量檢測。但此法不易檢測到低親和力的抗體，在包被或標(biāo)記藥品時可能會掩蓋或者變化藥品的抗原表位，并且檢測時也容易受到藥品本身的干擾[4-5]。RIPA法是以放射性標(biāo)記的抗原或抗體通過免疫沉淀檢測ADA。優(yōu)點是中檔或高通量水平，普通敏捷度高、特異性強、操作簡便、樣品及試劑用量少。但缺點是該辦法中標(biāo)記抗原的比活度和放化純度必須足夠高，并且所使用放射性同位素的半衰期也必須足夠長，否則有部分抗體無法被檢測到，造成定量不準(zhǔn)。并且同位素含有潛在放射性危害，同位素標(biāo)記還會影響表位的暴露，標(biāo)記藥品非特異性地夾帶在沉淀物中，相對于固相表面，結(jié)合力較弱。SPR技術(shù)是將藥品偶聯(lián)在傳感器芯片上，其可與樣品中的抗藥抗體結(jié)合[6]，使傳感器能夠間接檢測到抗藥抗體，最后通過系統(tǒng)擬合的結(jié)合曲線對ADA進行定量分析。該辦法的優(yōu)點是可實現(xiàn)實時、無標(biāo)記檢測，并且快速、敏捷、操作簡便，能檢測到不同親和力的抗體和各抗體亞型；缺點是所用試劑通用性差，通量低。ECL是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反映，可用磁珠或者石墨電極板作為反映載體。將生物素標(biāo)記的藥品與鏈霉親和素包被的微磁珠或石墨電極板相結(jié)合，運用該藥品去捕獲樣品中的ADA，然后再加入釕標(biāo)記的藥品，使其與ADA結(jié)合。形成免疫復(fù)合物后，以磁珠為載體的實驗運用磁場吸附磁珠，并用ProCell（在免疫分析系統(tǒng)中產(chǎn)生電化學(xué)信號的系統(tǒng)溶液）溶液將結(jié)合了磁珠的免疫復(fù)合物與未結(jié)合的組分分離，最后施加電壓啟動反映，激發(fā)釕發(fā)出光信號，通過采集光信號，并將光信號轉(zhuǎn)化成ADA濃度，得以實現(xiàn)對ADA的定量。而以石墨電極板作為反映載體的實驗，將電極表面通電后，通過電化學(xué)作用激發(fā)釕標(biāo)記物發(fā)出強光，同樣通過檢測光信號進行ADA的定量[7]。ECL法精密度高、敏捷度高、線性范疇寬、檢測時間短、反映體系可控、樣品用量少、通量高，缺點是需制備2種標(biāo)記物（生物素標(biāo)記的藥品和釕標(biāo)記的藥品），需要確保標(biāo)記物足夠穩(wěn)定，所用試劑通用性差。使用Gyrolab平臺進行免疫原性檢測，采用自動化進樣方式，將傳統(tǒng)的雙抗夾心大分子檢測辦法與微流控CD技術(shù)結(jié)合在一起，CD微構(gòu)造中裝有鏈霉親和素包裹的微珠填料，通過生物素捕獲試劑，與樣本特異性相結(jié)合，再與帶熒光團的檢測試劑結(jié)合，用工作站中的激光激發(fā)熒光，并用檢測器對吸附在樣本上的熒光標(biāo)記物進行讀數(shù)。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于生物分析中的配體結(jié)合實驗[8]。該技術(shù)的優(yōu)點是自動化、通量高、節(jié)省時間、試劑盒樣品用量少、檢測范疇廣、基質(zhì)效應(yīng)低。專用的GyrolabADA軟件還能夠協(xié)助擬定篩選臨界點和確證臨界點。1.1.2ADA檢測新興分析技術(shù)為滿足越來越嚴(yán)格的評價原則的規(guī)定，涌現(xiàn)出某些新興ADA檢測分析技術(shù)。免疫PCR法（Im-PCR），首先將ADA與固相上的藥品及生物素化藥品結(jié)合，從而形成“藥品-ADA-生物素化藥品”的橋梁，然后加入抗生物素-DNA復(fù)合物作為檢測試劑，通過擴增DNA，間接對ADA進行檢測[9-10]。該辦法也是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起的，用PCR擴增替代ELISA的酶催化底物顯色[11]。PCR含有很強的放大能力，能夠檢測稀釋后的ADA，不僅可減少基質(zhì)效應(yīng)，還含有非常高的敏捷度和特異性。與對應(yīng)的ELISA比較，Im-PCR可使ADA檢測的敏捷度提高約1000倍，并且本法中僅僅采用稀釋的辦法就能夠消除生物樣品中基質(zhì)的干擾[11]。SingulexErenna是基于單分子檢測技術(shù)（SMC）的免疫檢測系統(tǒng)，原理與傳統(tǒng)的ELISA很相似，只是在捕獲和檢測環(huán)節(jié)，藥品將每個ADA轉(zhuǎn)化成信號。在洗脫環(huán)節(jié)，熒光素標(biāo)記的檢測抗體從免疫復(fù)合物中解離下來，洗脫物被送入Erenna系統(tǒng)的毛細管中，毛細管上有一種非常微小的檢測空間可供激光照射。通過檢測空間時，單個的熒光素標(biāo)記抗體能夠產(chǎn)生熒光閃爍，從而被檢測到。SMC技術(shù)在獲得最優(yōu)化的免疫檢測效力的同時，操作流程相對更為簡便，該技術(shù)通過整合獨特的洗脫環(huán)節(jié)和敏捷的數(shù)字化檢測，相較于傳統(tǒng)免疫檢測技術(shù)，信噪比有了很明顯的改善，實現(xiàn)了能夠在一種系統(tǒng)里同時檢測低水平和高水平的ADA。SQISquidLite技術(shù)能夠在活化的玻璃表面上打印藥品的微陣列斑點[12]，加入待測樣品后，ADA就會與藥品結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合ADA，通過檢測熒光強度對ADA進行分析。該平臺實現(xiàn)了在同一孔中進行ADA及其亞型的檢測，能夠避免多次檢測帶來的樣本量的損耗。該技術(shù)與ELISA或ECL相比，有更高的敏感性和耐藥性。它的重要優(yōu)勢體現(xiàn)在，當(dāng)需要進行檢測抗體分型時能夠多路復(fù)用，自動化系統(tǒng)還含有高通量特性。然而該平臺使用專用緩沖器，前期需要大量成本。GenalyteMaverick系統(tǒng)也能夠?qū)崿F(xiàn)同時檢測ADA及其亞型。該技術(shù)平臺，將藥品捕獲探針印刷在硅光子生物傳感器表面，樣品中的ADA會被藥品捕獲，使用結(jié)合在鏈霉親和素包被珠上的生物素化藥進行檢測，由于珠子的加入變化了原樣品溶液的折射率，然后根據(jù)折射率的變化，就能夠測定ADA[8]。該系統(tǒng)能夠檢測全部免疫球蛋白亞型，涉及單價的IgG4。然而該平臺規(guī)定樣品進行酸解離預(yù)解決，然后用包被在96孔板上的藥品親和捕獲ADA，ADA要在低pH下洗脫和中和。SQISquidLite技術(shù)和GenalyteMaverick系統(tǒng)都有可自動化的優(yōu)勢，但是后者不需要標(biāo)記，并且能夠進行實時動態(tài)讀取成果，而前者只有最后的成果讀數(shù)，并且現(xiàn)在使用較少。1.2ADA檢測中重要干擾因素及解決辦法1.2.1樣品基質(zhì)中循環(huán)藥品的干擾及解決辦法免疫原性檢測，會受到樣品基質(zhì)中循環(huán)藥品的干擾，過量的藥品與ADA結(jié)合，會造成ADA檢測假陰性成果?，F(xiàn)在ADA分析中有多個辦法來提高藥品耐受性，減少或避免由于游離藥品的存在造成的假陰性成果，避免對ADA的低估。由于ADA在樣品中會有兩種存在形式，即游離ADA和ADA-藥品復(fù)合物[13]。游離的ADA相對比較容易檢測到，想要同時檢測與藥品結(jié)合的ADA，單獨運用上述某一種辦法或技術(shù)平臺難以實現(xiàn)。為了克服ADA檢測過程中受到的多個干擾，需要對樣品進行預(yù)解決，現(xiàn)在重要的預(yù)解決辦法有吸附小柱去除游離藥品、酸解離或堿解離（絕大多數(shù)狀況下為酸解離）、磁珠提取和酸解離（BEAD）、固相提取和酸解離（SPEAD）等辦法。1.2.1.1吸附小柱去除游離藥品吸附小柱可與藥品特異性結(jié)合的物質(zhì)（抗人IgG單克隆抗體或多克隆抗體）與固相載體（瓊脂糖樹脂、磁性顆粒、芯片或微流體）偶聯(lián)，該物質(zhì)不與樣品中除游離藥品之外的其它成分反映，可特異性地結(jié)合待測樣品中的游離藥品，能夠使其后的ADA檢測中（如使用橋接ELISA法）避免游離藥品與標(biāo)記試劑競爭結(jié)合待檢測的ADA所致的干擾，涉及對ADA檢測的低估或假陰性成果[14]。這個辦法不僅有效地減少了藥品對抗藥抗體檢測的干擾，同時還提高了檢測敏捷度。但該辦法只是去除樣品中游離的藥品，而已經(jīng)與ADA結(jié)合的藥品難以去除，藥品-ADA復(fù)合物仍舊會影響檢測成果[藥研公眾號整頓排版]。1.2.1.2酸解離酸解離是較為常見的預(yù)解決手段[5]。具體地說，酸解離是通過酸化樣品來實現(xiàn)將ADA-藥品復(fù)合物解離成ADA和藥品，但這僅是在酸性條件下的存在形式，酸化后的樣品需要在pH回到中性時方可被用于ADA的檢測。此時，樣品中的部分藥品和抗藥抗體又重新形成ADA-藥品復(fù)合物。并且，酸解決能夠分解藥品-靶點復(fù)合物，可能會將游離靶點釋放到樣品基質(zhì)中，造成假陽性成果。但酸解離的最大目的是使得原來已與藥品結(jié)合的抗藥抗體最少有部分能夠被檢測到，如果不采用酸解的話，可能檢測不到ADA。在使用酸解離解決樣品的ECL檢測辦法中，即使酸化后樣品中的抗藥抗體在中性pH條件下，僅僅只有部分會同時與電極板微孔中生物素化的藥品以及釕標(biāo)記的藥品結(jié)合，但仍然可被檢測出來。在所用酸解試劑不影響ADA性質(zhì)的前提下，此辦法簡樸，易操作。1.2.1.3BEAD和SPEADBEAD法與SPEAD法原理相似，兩者均是在載體上包被鏈霉親和素以結(jié)合生物素-藥品偶聯(lián)物，差別在于BEAD法提取ADA的載體是磁珠，SPEAD法提取ADA的載體是鏈霉親和素包被的石墨電極板或酶標(biāo)板[15-18]。在這兩種辦法中，藥品-ADA復(fù)合物在低pH條件下解離，當(dāng)溶液中和后，加入生物素-藥品偶聯(lián)物，與游離藥品競爭結(jié)合ADA，生物素-藥品偶聯(lián)物與ADA結(jié)合后被捕獲在鏈霉親和素包被的載體（磁珠或板）上。捕獲的ADA再次在低pH條件下解決洗脫，然后進行檢測。相對而言，SPEAD法含有操作簡樸和材料價格較低的優(yōu)勢，但與磁珠相比，板的結(jié)合能力相對較低。根據(jù)本實驗室經(jīng)驗，同樣條件下，BEAD法得到的檢測成果相對穩(wěn)定，易重復(fù)。1.2.1.4沉淀和酸解離Zoghbi等[19]開發(fā)了一種突破性的新辦法，即采用沉淀和酸解離（PandA）相結(jié)合的辦法來克服ADA檢測中的藥品干擾。該辦法的原理是將過量的藥品添加到含ADA的血清樣品中并孵育，以形成ADA-藥品復(fù)合物。初次孵育后，在樣品中添加PEG并孵育以使復(fù)合物沉淀。對沉淀進行一系列洗滌，最后一次洗滌后，將沉淀用乙酸解離，使ADA-藥品復(fù)合物解離成ADA和藥品，并直接包被到石墨電極板上。孵育后，將板封閉，然后加入釕標(biāo)記的藥品與包被的ADA結(jié)合，通過ECL辦法對ADA進行檢測。在他們的辦法中，分別使用了人源化IgG1、全人源IgG4和人源化IgG4單抗藥品進行實驗，均證明了該辦法的合用性。然而本實驗室在實際應(yīng)用該辦法時發(fā)現(xiàn)，由于操作環(huán)節(jié)較多，分離沉淀和上清液難度也較大，而PEG的濃度也會影響敏捷度和特異性，因此不擬定因素較多，造成重復(fù)性較差。1.2.2基質(zhì)中可溶性靶標(biāo)的干擾及解決辦法對于單抗藥品，可溶性靶標(biāo)的干擾也是一種特別含有挑戰(zhàn)性的問題?？扇苄缘亩垠w或多聚體藥品靶標(biāo)能夠在兩個標(biāo)記藥品分子之間形成橋梁，容易造成ADA假陽性成果。單克隆抗體藥品ADA檢測中，對于可溶性靶標(biāo)的干擾問題，現(xiàn)在普通采用的解決辦法是將基質(zhì)中的可溶性靶點進行去除，普通能夠用靶點克制劑（普通為對應(yīng)的抗靶點抗體）去結(jié)合靶點，可去除靶點的干擾作用，提高靶點耐受性[20]。1.2.3基質(zhì)中類風(fēng)濕因子的干擾及解決方法類風(fēng)濕因子（RF）是以變性的IgG的Fc片段為靶抗原的本身抗體，RF不僅可與變性的IgG結(jié)合，也與本身IgG或異體IgG反映，常對免疫檢測造成干擾。在檢測ADA時，如果用的捕獲抗體和檢測抗體均為IgG，樣本基質(zhì)中的RF能同時與兩者結(jié)合，形成捕獲抗體-RF-檢測抗體復(fù)合物，從而產(chǎn)生ADA假陽性。而當(dāng)RF只能與其中一種抗體結(jié)合時，又會造成空間位阻，造成假陰性成果的產(chǎn)生。對于存在RF干擾的樣本，可通過對樣本進行前解決以消除或盡量減少其干擾。慣用的辦法涉及：分析前在樣本中加入動物血清或IgG，或加入封閉阻斷試劑；用包被IgG的固體顆粒吸附；使用阻斷試管采集樣本等[21]。前文所述的檢測辦法和平臺多數(shù)都較為傳統(tǒng)，普通都是在前解決過程中將ADA-藥品復(fù)合物分開，然后單獨檢測ADA。與否能夠?qū)崿F(xiàn)在ADA-藥品復(fù)合物不分開的狀況下檢測ADA，值得進一步探究。2NAb的檢測藥品的中和抗體指能夠中和藥品活性的抗藥抗體，單抗藥品的中和抗體是與單抗互補決定區(qū)（CDR）特異性結(jié)合的抗藥抗體[22]。在某些狀況下，NAb還能夠與內(nèi)源性對應(yīng)物發(fā)生交叉反映，從而造成某些正常生理功效受損和危及生命的副作用。因此NAb的表征已經(jīng)成為評定生物技術(shù)藥品安全性和有效性的重要要素。2.1NAb檢測辦法NAb檢測普通分為兩類：基于細胞的分析檢測（CBA）和競爭性配體結(jié)合分析檢測（CLBA）[23]。CBA辦法使用體現(xiàn)藥品預(yù)定靶點的細胞，樣品中的NAb制止了藥品與其靶點結(jié)合產(chǎn)生的細胞效應(yīng)，從而根據(jù)細胞效應(yīng)削弱的程度進行NAb分析；CLBA辦法是通過評價可溶性靶點和樣品中NAb對藥品的競爭性結(jié)合，再結(jié)合ELISA或ECL平臺進行NAb檢測。對于NAb檢測，監(jiān)管機構(gòu)推薦基于細胞的分析檢測作為首選辦法，由于細胞反映更能反映NAb在體內(nèi)對藥品的影響[3]?？贵w依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性（ADCC）是一種常見的治療性抗體藥品的作用機制。Wu等[23]建立、優(yōu)化了一種基于ADCC的NAb檢測辦法，用該辦法來檢測貝那利珠單抗予以人后誘導(dǎo)的NAb。其原理是貝那珠單抗與靶細胞上的人IL-5R結(jié)合，并且貝那珠單抗的Fc區(qū)通過CD16與效應(yīng)細胞結(jié)合，從而誘導(dǎo)靶細胞的ADCC。ADCC活性與熒光素酶報告基因的激活親密有關(guān)。在含有NAb的血清樣品中，ADCC就會被NAb克制，造成熒光素酶信號（RLU值）減少。產(chǎn)生的熒光素酶信號與樣品中存在的NAb數(shù)量成反比。即使該辦法藥品耐受性和敏捷度都不是很高，但用于檢測臨床樣本是可行的。美國瑞澤恩制藥公司發(fā)明了用于檢測中和抗體的競爭性配體結(jié)正當(dāng)[24]，該辦法簡樸來說涉及下列環(huán)節(jié)，首先要獲取樣品，然后在捕獲試劑（普通為生物素標(biāo)記的治療性蛋白藥品）存在下孵育樣品，最后加入檢測試劑。其中相對于對照樣品減少的信號批示針對蛋白多肽或單抗藥品的中和抗體存在。該辦法敏捷度較高，特異性較強，動態(tài)范疇較廣，檢測時間較短，有相對更高的藥品耐受性。Wu等[23]曾通過檢測貝那利珠單抗的中和抗體對比了CBA與CLBA兩種辦法在檢測NAb時精密度、敏捷度以及藥品耐受性等方面的差別。CLBA與CBA批內(nèi)變異相稱，與CBA相比，CLBA批間變異相對小得多，因此CLBA比CBA精密度更高。CLBA對單克隆ADA陽性對照及多克隆ADA陽性對照的檢測敏捷度也相對較高。另外，盡管兩種辦法的藥品耐受性都是有限的，但CLBA藥品耐受性約為2.5倍（可檢測到的NAb濃度與藥品濃度比），而CBA則只有1.6倍，因此CLBA藥品耐受性同樣相對較高。Hu等[25]在3項臨床研究中也進行了CBA和CLBA法的對比，其中兩項研究成果表明CBA和CLBA檢測中和抗體的能力相稱，在第三項研究中，CLBA體現(xiàn)相對較差。由此可見，無論是CBA還是CLBA，都有本身的優(yōu)勢和局限性，應(yīng)根據(jù)每一種藥品獨特的作用機制、免疫風(fēng)險評定以及技術(shù)可行性評定去選擇和設(shè)計NAb檢測辦