第十七節(jié)血紅蛋白的提取和分離二

血紅蛋白的提取和分離（二）主講：黃岡中學(xué)優(yōu)秀生物教師王小敏回想上節(jié)課：二、實(shí)驗(yàn)操作閱讀血液構(gòu)成成分，思考：1、血液由血漿和血細(xì)胞兩部分構(gòu)成。2、血細(xì)胞中紅細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含量最高的有機(jī)化合物是血紅蛋白。3、該化合物是由2條α-肽鏈和2條β-肽鏈構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一種能與O2和CO2結(jié)合的亞鐵血紅素基團(tuán)。（一）樣品解決本課題可選用豬、牛、羊或其它脊椎動(dòng)物的血液來分離血紅蛋白。思考1：你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動(dòng)物血液中，最佳哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？哺乳動(dòng)物血液。由于該細(xì)胞中沒有細(xì)胞核，血紅蛋白含量高。1、紅細(xì)胞的洗滌：①洗滌目的：是去除雜蛋白。以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。②洗滌辦法：思考2：加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時(shí)離心？為什么要緩慢攪拌？避免血液凝固；避免白細(xì)胞沉淀；避免紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。2、血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積，再加40%體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充足攪拌10分鐘。思考3：加入的蒸餾水、甲苯的作用分別是什么？充足攪拌的目的是什么？蒸餾水的作用：使紅細(xì)胞大量吸水脹裂。甲苯的作用：溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜。充足攪拌的目的：加速紅細(xì)胞的破裂。3、分離血紅蛋白溶液：（二）粗分離——透析1、過程：將血紅蛋白溶液裝入透析袋，置于磷酸緩沖液（pH為7.0）中，透析12小時(shí)。在透析過程中，血紅蛋白不能通過半透膜，而離子和小分子能夠通過半透膜擴(kuò)散進(jìn)入磷酸緩沖液中。2、透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。（三）純化——凝膠色譜操作1、凝膠色譜柱的制作：①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：橡皮塞打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)造成液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按對(duì)應(yīng)位置組裝成一種整體。⑤安裝其它附屬構(gòu)造。2、凝膠色譜柱的裝填裝填材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）、20mmol/L磷酸緩沖液“G”：表達(dá)凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范疇。75：表達(dá)凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。環(huán)節(jié)操作規(guī)定①固定色譜柱色譜柱垂直固定在支架上②計(jì)算稱量凝膠根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量③配制懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充足溶脹或：凝膠顆粒＋洗脫液→沸水?、苎b填懸浮液一次性緩慢倒入；輕輕敲打⑤緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h注意事項(xiàng)：①凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以減少凝膠顆粒之間的空隙。②裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在。由于氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，減少分離效果。③洗滌時(shí)，液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最后身物大分子物質(zhì)的分離效果。④不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。3、樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁圍繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。④洗脫：小心加入pH＝7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適宜高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)靠近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，持續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，闡明色譜柱制作成功）注意事項(xiàng)：對(duì)的的加樣操作：①不要觸及并破壞凝膠面。②貼壁加樣。③使吸管管口沿管壁圍繞移動(dòng)。（四）純度鑒定——聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定（略）三、操作提示1、紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時(shí)離心。2、色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，減少顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。3、凝膠的預(yù)解決：沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡4、色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。四、成果分析與評(píng)價(jià)1、你與否完畢了對(duì)血液樣品的解決？你能描述解決后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？觀察你解決的血液樣品離心后與否分層，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的因素。另外，離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。2、你裝填的凝膠色譜柱與否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此能夠在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠與否裝填得均勻。另外，還能夠加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的狀況。如果色帶均勻、狹窄、平整，闡明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請(qǐng)描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)狀況，并據(jù)此判斷分離效果？如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也對(duì)的的話，能清晰地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，闡明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。課堂小結(jié)：

-返回-同時(shí)測(cè)試一、選擇題1、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的根據(jù)是（）A．對(duì)其它分子的親和力B．溶解度C．所帶電荷多少D．相對(duì)分子質(zhì)量的大小2、凝膠色譜法中所用的凝膠化學(xué)本質(zhì)大多是（）A．糖類化合物B．脂質(zhì)C．蛋白質(zhì)D．核酸3、選用紅細(xì)胞作為分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料，有何好處（）A．血紅蛋白是有色蛋白B．紅細(xì)胞無細(xì)胞核C．紅細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高D．紅細(xì)胞DNA含量高4、將攪拌好的混合液離心來分離血紅蛋白溶液時(shí)，第二層是（）A．甲苯B．血紅蛋白水溶液C．脂溶性物質(zhì)的沉淀層D．其它雜質(zhì)的沉淀5、血紅蛋白因含有（）而呈紅色。A．O2B．COC．CO2D．血紅素6、下列操作對(duì)的的是（）A．分離紅細(xì)胞時(shí)采用低速長(zhǎng)時(shí)間離心B．紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可C．分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心D．透析時(shí)要用20mmol/l的磷酸緩沖液，透析12h7、樣品的加入和洗脫的敘述對(duì)的的是（）A．先加入1ml透析后的樣品B．加樣前要使緩沖液緩慢下降全部流出C．如果紅色帶均勻一致的移動(dòng)，闡明色譜柱制作成功D．洗脫時(shí)能夠用緩沖液也能夠用清水8、下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程度敘述錯(cuò)誤的是（）A．樣品的解決就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液B．通過透析能夠去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取C．可通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化D．可通過SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度9、凝膠色譜法操作對(duì)的的是（）A．將橡皮塞上部用刀切出鍋底狀的凹穴B．將橡皮塞下部切出凹穴C．插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面D．將尼龍網(wǎng)剪成與橡皮塞下部同樣大小的圓片10、樣品的加入和洗脫的操作不對(duì)的的是（）A．加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C．等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D．用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面DAADDDCBAD二、非選擇題11、電泳運(yùn)用了待分離樣品中多個(gè)分子__________以及__________、__________的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速率，從而實(shí)現(xiàn)樣品中多個(gè)分子的分離。顯示答案11、帶電性質(zhì)的差別；分子本身的大小；形狀的不同12、下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時(shí)樣品的加入（圖Ⅰ）和洗脫（圖Ⅱ）示意圖，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題。（1）在加樣示意圖中，對(duì)的的加樣次序是__________。（2）用吸管加樣時(shí)，應(yīng)注意對(duì)的操作，分別是①__________②__________③__________（3）等樣品__________時(shí)，才加入緩沖液。（4）待__________靠近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每__________mL收集一管，持續(xù)收集。顯示答案12、（1）④→①→②→③（2）不要觸及破壞凝膠面貼著管壁加樣使吸管管口沿管壁圍繞移動(dòng)（3）完全進(jìn)入凝膠層（4）紅色的蛋白質(zhì)513、血紅蛋白是人和其它脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的重要構(gòu)成成分，負(fù)責(zé)血液中O2、CO2的運(yùn)輸。請(qǐng)根據(jù)血紅蛋白的提取和分離流程圖回答下列問題。

（1）將實(shí)驗(yàn)流程補(bǔ)充完整：A為__________，B為__________。凝膠色譜法的基本原理是根據(jù)__________來分離不同種類的蛋白質(zhì)。（2）洗滌紅細(xì)胞的目的是去除__________。洗滌干凈的標(biāo)志是__________。釋放血紅蛋白的過程中起作用的是_________。（3）透析的作用是____________________。顯示答案13、（1）血紅蛋白的釋放樣品的加入和洗脫相對(duì)分子質(zhì)量的大?。?）去除雜蛋白，利于后續(xù)環(huán)節(jié)的純化上清液中沒有黃色蒸餾水和甲苯（3）去除小分子雜質(zhì)-END-課外拓展電泳（1）根據(jù)闡明書安裝電泳用的玻璃板。（2）配制SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液。用去離子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris緩沖液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的過硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均勻，快速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間（梳子的齒長(zhǎng)再加0.5cm），再在膠液面上小心注入一層水（約高2～3mm），以制止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。（3）分離膠聚合完全后（約30min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。（4）配制SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液。用去離子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris緩沖液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的過硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立刻在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個(gè)操作過程應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn)生。然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。（5）在等待濃縮膠聚合時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)行解決。在電泳樣品中按1∶1體積比加入樣品解決液，在100℃溫度下加熱3min，以使蛋白質(zhì)變性。（6）濃縮膠聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡。（7）按次序加樣，加樣量普通為10～25μL。樣品能夠多加幾個(gè)，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后（即進(jìn)行凝膠色譜分離之前）的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品。（8）將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)達(dá)成分離膠底部上方約1cm處，關(guān)閉電源。（9）從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方位。（10）將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1～2h。換脫色液脫色3～10h，其間需多次更換脫色液至背景清晰。脫色后，可將凝膠浸于水中，長(zhǎng)久封裝在塑料袋內(nèi)使其不會(huì)減少染色強(qiáng)度。為保存永久性統(tǒng)計(jì)，可對(duì)凝膠進(jìn)行拍照，或?qū)⒛z干燥成膠片。通過本實(shí)驗(yàn)的電泳圖譜，能夠看見提取的血紅蛋白的純度并不是很高。

-END-高考解析例、下列有關(guān)DNA和蛋白質(zhì)提取與分離實(shí)驗(yàn)的敘述，對(duì)的的有（）A．提取細(xì)胞中的DNA和蛋白質(zhì)都需用蒸餾水漲破細(xì)胞B．用不同濃度N