甜菜堿對(duì)hepg2內(nèi)基因組范圍dna甲基化表達(dá)的影響

甜菜堿對(duì)hepg2內(nèi)基因組范圍dna甲基化表達(dá)的影響

甜菜堿是一種親水水生植物。它是甘氨酸的三甲基衍生物，也被稱為甘氨酸甜草堿和三甲基甘氨酸。由于甜菜堿的相對(duì)分子質(zhì)量不大,并有3個(gè)活性甲基,在分子內(nèi)部正負(fù)電荷也已得到中和,因此,它是高效的甲基供體。它可被細(xì)胞吸收并參與細(xì)胞內(nèi)的甲基轉(zhuǎn)移過程。DNA甲基化作用是在真核生物體內(nèi)普遍存在的一種基因內(nèi)源修飾作用,是指由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化,把S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶5位碳原子上,生成5-甲基胞嘧啶(5mdC)的過程,但異常甲基化則可成為腫瘤發(fā)生的重要因素之一。在許多的人類腫瘤中都可以發(fā)現(xiàn)不同程度的DNA異常甲基化現(xiàn)象。DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生和演變密切相關(guān),它可通過基因組總體水平甲基化程度的降低和某些啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度的增高造成基因功能的失活,從而導(dǎo)致腫瘤的形成。最近的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞中存在著與正常細(xì)胞不同的甲基化模式,可分為甲基化增強(qiáng)、甲基化減弱和甲基化酶Mtase水平提高三種類型。細(xì)胞基因的遺傳性及表觀遺傳性變異所致細(xì)胞周期的改變是惡性腫瘤的重要發(fā)病機(jī)制。在諸多調(diào)控細(xì)胞周期的影響因素中,DNA甲基化造成的表觀遺傳改變逐漸引起了人們的重視。就目前的研究發(fā)現(xiàn),DNA甲基化與越來越多的細(xì)胞周期調(diào)控基因關(guān)系密切。前期研究表明甜菜堿可抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng),改變細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡,顯示甜菜堿具有抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)初步探討甜菜堿作為甲基供體,對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG2中整體基因組范圍DNA甲基化表達(dá)水平的細(xì)胞周期途徑的影響,進(jìn)一步研究甜菜堿抗腫瘤作用機(jī)制。1材料表面1.1腫瘤細(xì)胞瘤人肝癌細(xì)胞HepG2購自美國(guó)ATCC,黑龍江省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所傳代保種。1.2適合自己的耐藥藥物小牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶,(Gibco公司);甜菜堿(浙江綠成生物技術(shù)有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%);蛋白酶K、SDS、RNAaseA、nucleaseP1、2′-Deoxyadenosine(dA)、2′-deoxy-thymidine(dT)、2′-deoxyguanosine(dG)、2′-deoxycytidine(dC)、5-甲基胞嘧啶(5mdC),均購自Sigma公司;堿性磷酸酶(Fermentas公司);MTT(Sigma公司);碘化丙啶(PI,Angus公司);核糖核酸酶A(RNaseA,北京化學(xué)試劑公司);TritonX—100(Farco公司);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3超凈工作臺(tái)以及高效毛細(xì)管電泳儀CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)NBS公司);奧林巴斯CKX—41—32倒置顯微鏡(日本Olympus公司);超凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司);純水儀(美國(guó)Milipore公司);旋渦混合器(美國(guó)BohemiaN.Y公司);高效毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)Beckman-Coulter公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman-Coulter公司)。1.4蛋白酶k1×PBS緩沖液為NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.63g、KH2PO40.24g,加蒸餾水至1000mL;TE緩沖液為Tris·Cl(pH8.0)10mmol/L、EDTA1mmol/L;細(xì)胞裂解液為Tris·Cl(pH8.0)10mmol/L、NaCl10mmol/L、EDTA1mmol/L、蛋白酶K100mg/L、SDS10g/L;蛋白酶K溶液為細(xì)胞裂解液配制0.5mL,則加入20mg/mL蛋白酶K2.5μL;堿性磷酸酶溶液:堿性磷酸酶50U/mL,溶解于2.5mol/L硫酸銨中;PI染液:生理鹽水32.4mL、PI2.5mg、RNaseA0.5mg、TritonX—1000.25mg、枸櫞酸鈉50mg,加蒸餾水至50mL,于棕色量瓶4℃避光貯存。2血清rpmi-1330HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置于37℃、相對(duì)濕度95%、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3d傳代1次。2.2細(xì)菌分離和清洗法分離dna取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞,濃度為2×105/mL,鋪于6孔板中,每孔1mL,貼壁24h后,取出培養(yǎng)的細(xì)胞,給藥組分別加入終濃度為0.1、0.2、0.4mol/L的甜菜堿,陰性對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)液。分別于藥物作用24、48h后收集細(xì)胞,胰蛋白酶消化后,用PBS將細(xì)胞吹下,洗3次后收集到離心管中,4℃、1500×g離心10min收獲細(xì)胞。用5～10倍體積預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞并再次離心。TE緩沖液(pH8.0)將細(xì)胞重懸至濃度為5×107/mL,加入抽提緩沖液(每毫升細(xì)胞懸液加入10mL抽提液),于37℃溫育1h,加入蛋白酶K至終質(zhì)量濃度為100μg/mL,置于50℃水浴中3h。將溶液冷卻至室溫,加入等體積的酚(水飽和酚與異戊醇混合,比例為25∶24),緩慢的來回顛倒離心管10min,小心混合兩相。于室溫以5000×g離心15min,使兩相分離。將黏稠的水相移至一潔凈的離心管中,加水飽和酚重復(fù)抽提2次。收集水相,加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和2倍體積的冷乙醇,DNA沉淀后,于室溫以5000×g離心5min收集。用70%冷乙醇洗滌DNA沉淀2次,DNA沉淀懸于70%乙醇中,-20℃冰箱中保存。把懸于乙醇中的DNA樣品離心,收集沉淀,將DNA重新懸浮在Milli-Q水中,質(zhì)量濃度為0.5μg/mL,4℃保存。DNA樣品(3μL,0.5μg/μL)在沸水中加熱2min后,在冰浴中迅速冷卻,然后加入0.75μL10mmol/L硫酸鋅和1.25μLnucleaseP1后,37℃水浴中溫育16h。加入1.25μLTris(0.5mol/L,pH8.3)和0.75μL堿性磷酸酶,混勻后37℃水浴繼續(xù)溫育2h。取出后離心,4℃保存。使用的毛細(xì)管為未涂層熔融硅毛細(xì)管(60cm×75μm,有效長(zhǎng)度57cm)。在本實(shí)驗(yàn)中,pH9.6,16、32、48、64mmol/LNaHCO3作為緩沖液分別被采用進(jìn)行試驗(yàn),每個(gè)緩沖液中還加入20～80mmol/L的SDS。溫度20～35℃,電壓在175～500V/cm,吸收波長(zhǎng)為254nm。最后以緩沖溶液48mmol/LNaHCO3,pH9.6,緩沖溶液中加入60mmol/LSDS,電壓17kV/cm,20℃,實(shí)驗(yàn)方案較好。清洗液為0.1mol/LHCl、0.1mol/LNaOH、去離子水。電泳運(yùn)行之前,毛細(xì)管首先用HCl洗2min,然后用去離子水洗2min,再用NaOH洗1min,最后充滿緩沖液3min。緩沖液和洗液預(yù)先用0.45μm濾膜過濾。被水解的樣品在陰極之上9.8cm處30s內(nèi)注入。樣品的甲基化定量采用5mdC占總體胞嘧啶的峰面積的百分比進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,兩組間比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。3甜菜堿對(duì)hepg2細(xì)胞mtd的影響毛細(xì)管電泳儀分析甜菜堿對(duì)HepG2細(xì)胞甲基化表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,甜菜堿作用于HepG2細(xì)胞24、48h后,采用高效毛細(xì)管電泳法檢測(cè)HepG2細(xì)胞DNA中5mdC的量。如表1中所示,細(xì)胞內(nèi)的5mdC均顯著高于陰性對(duì)照組,甜菜堿0.4、0.2mol/L劑量組與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。3個(gè)劑量組升高5mdC的強(qiáng)度具一定的劑量依賴性。從給藥時(shí)間長(zhǎng)度來看,48h時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞內(nèi)的5mdC升高的幅度較大,24h升高幅度相對(duì)較小。4甜菜堿在肺癌細(xì)胞中的應(yīng)用DNA甲基化影響人類基因組的效果包括轉(zhuǎn)錄抑制,染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾和X染色體失活,基因組印跡,抑制重復(fù)序列和寄生DNA成分對(duì)基因組完整性的損害作用。在腫瘤細(xì)胞中基因組甲基化模式常常發(fā)生改變,出現(xiàn)整體的低甲基化伴隨著特定區(qū)域的高甲基化。當(dāng)腫瘤抑制基因發(fā)生高甲基化,造成相關(guān)基因表達(dá)沉默,并可出現(xiàn)細(xì)胞以缺失或者突變的方式惡性生長(zhǎng)?，F(xiàn)有的研究多數(shù)僅限于DNA原有的甲基化狀態(tài)或認(rèn)為對(duì)其去甲基化后對(duì)基因表達(dá)的影響,很少涉及促甲基化反應(yīng)的研究。目前有3種機(jī)制解釋基因組整體的低甲基化在腫瘤中所扮演的作用。第一,低甲基化導(dǎo)致原癌基因的去甲基化失活如MYC原癌基因失活;第二,整體的低甲基化是細(xì)胞染色體不穩(wěn)定的易感因素;第三,低甲基化使腫瘤轉(zhuǎn)移增加。但是促甲基化同樣可以通過癌遺傳學(xué)途徑基因的釋能與獲能,改變基因組的不穩(wěn)定性等途徑為腫瘤的防治提供新的干預(yù)點(diǎn),與去甲基化相對(duì)應(yīng),他的基因分子生物學(xué)中也有著廣闊的應(yīng)用前景。在人類基因組DNA中,約3%～4%的胞嘧啶堿基以5-甲基胞嘧啶(5mdC)形式存在,多種腫瘤的研究結(jié)果表明,腫瘤組織相對(duì)于正常組織整體呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài),這種特征可以通過檢測(cè)基因組中DNA甲基化胞嘧啶的豐度或者尋找?guī)в屑谆舾行悦傅闹貜?fù)序列來觀察。本實(shí)驗(yàn)主要探討甜菜堿促人肝癌細(xì)胞HepG2基因組范圍為DNA甲基化高表達(dá)作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,采用了高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)法來檢測(cè)甜菜堿作用的HepG2人肝癌細(xì)胞基因組范圍的DNA甲基化水平變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HPCE處理DNA水解產(chǎn)物,用紫外光測(cè)定吸收峰值,以確定5mdC水平,再通過公式計(jì)算面積比,發(fā)現(xiàn)基因組整體的甲基化水平是隨著給藥濃度的增加而增加,而在腫瘤細(xì)胞DNA中5mdC的量也跟著上升,有一定的劑量依賴性,說明甜菜堿可促進(jìn)HepG2細(xì)胞基因組范圍DNA甲基化水平的升高。當(dāng)腫瘤細(xì)胞DNA甲基化水平提高時(shí),有可能恢復(fù)因?yàn)槿ゼ谆Щ钤┗?或平衡細(xì)胞染色體不穩(wěn)定的易感因素,或?qū)е录?xì)胞周期調(diào)控失常,信號(hào)傳導(dǎo)等來達(dá)到抑制腫瘤的作用。研究提示,甜菜堿可能通過促使腫瘤細(xì)胞DNA甲基化的升高,使得DNA甲基化模式隨著細(xì)胞分裂穩(wěn)定的復(fù)制,而甲基化的異常更易于