葡萄糖測定的不確定度評定

葡萄糖測定的不確定度評定

檢測方法的選擇血清中葡萄糖的含量是人體健康的重要指標。空腹靜脈血漿血糖濃度低于3.33～3.89mmol/L時稱為低血糖,而超過7.80mmol/L時稱為高血糖。血糖含量測定是臨床檢驗中最重要的指標之一,它可為糖尿病、高血壓以及心腦血管系統(tǒng)等疾病的診斷、療效觀察、病程檢測、疾病預防等提供客觀依據(jù)。目前,血清葡萄糖常用的檢測方法主要有葡萄糖氧化酶(GOD-POD)法、微電流法、氧速率法、己糖激酶法(HK法)、氣相色譜/同位素稀釋質(zhì)譜法(GC-ID/MS法)等。其中,ID/MS是微量、痕量和超痕量物質(zhì)含量的權(quán)威測量方法。HK法、GOD-POD法與GC-ID/MS法相比較,血糖濃度在5.6～10mmol/L時相對標準偏差分別為19.27%、19.20%和1.65%,10mmol/L以上時相對標準偏差分別為27.31%、24.19%和2.24%?？梢奊C-ID/MS法測定的標準偏差遠遠小于另兩種方法。本文通過向樣品溶液中加入同位素標記物作為內(nèi)標物,利用GC-MS測定標記物與溶質(zhì)的峰強度比來測定溶質(zhì)的濃度。該法特異性高、準確度好。1實驗部分1.1化學試劑及儀器冰凍混合人血清,軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所;D-葡萄糖純度標準品,純度為99.8%,美國Amersco公司;D-[13C6]葡萄糖標記物,同位素豐度大于99.9%,英國CambridgeIsotopeLaboratories,Inc;疊氮化鈉,分析純,德國Merck公司;鹽酸羥胺,分析純,國藥集團化學試劑有限公司;吡啶,分析純,美國TEDIA公司;乙酸酐,分析純,北京化工廠;二氯甲烷,色譜純,德國Riedel-deHa?n公司;乙酸乙酯,分析純,天津市津科精細化工研究所;無水乙醇,分析純,美國JTBaker公司;實驗用水為高純?nèi)握麴s水(Millipore,0.22μm)。ThermoFinniganDSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國熱電公司;MettlerToledoUMX2天平,瑞士梅特勒公司;TouchMixerMT-51渦旋振蕩器,日本Yamato公司;BF-2000A氮氣吹干裝置,八方世紀公司;LD5-2A離心機,北京醫(yī)用離心機廠。1.2樣品樣品制備1.2.1葡萄糖標記物純度精確稱取一定質(zhì)量的D-葡萄糖純度標準品、D-[13C6]葡萄糖標記物純度標準品溶于一定體積0.1%疊氮化鈉溶液中,使各自質(zhì)量分數(shù)與血清中葡萄糖質(zhì)量分數(shù)初測值接近,分別約為1.15×10-3和1.38×10-3。1.2.2標準曲線的確定根據(jù)血清樣品中葡萄糖的大致濃度,移取體積一定的葡萄糖標記物標準溶液,加入至一定體積的葡萄糖標準溶液,保證二者濃度比例范圍約為(0.95,1.05),輕搖混勻、充分平衡。1.2.3葡萄糖標記物的添加量待血清樣品室溫平衡后,根據(jù)血清樣品中葡萄糖的大致濃度,向樣品中加入一定體積的葡萄糖標記物標準溶液,輕搖、在4℃冰箱平衡過夜,使血清樣品中葡萄糖與添加的葡萄糖標記物二者濃度比例范圍約為1∶1。1.3鹽酸羥胺的合成向已添加標記物的樣品中加入1mL無水乙醇,振蕩混勻,在4℃下以5000r/min離心10min除去蛋白,取上層清液,過0.22μm有機濾膜,60℃下N2吹干。加入400μL鹽酸羥胺的吡啶溶液,90℃下反應30min。冷卻后,再加入600μL乙酸酐,90℃下反應60min。冷卻,加入1.5mL水和0.5mL二氯甲烷,充分振蕩、靜置10min以上,取下清液50℃下N2吹干,加入150μL乙酸乙酯復溶,移至色譜分析瓶中。將校準比值混合溶液60℃下N2吹干,處理方法同前。將樣品進行GC-ID/MS分析。1.4分析1.4.1初始溫度和進樣方式DB-1701毛細管色譜柱30m×0.25mm×0.25μm(膜厚),載氣為高純氦氣(純度≥99.999%),流速1.5mL/min。柱溫初始溫度125℃,以20℃/min速率升溫到180℃,再以5℃/min速率升溫到280℃,保持20min。進樣方式為不分流;進樣量1μL,進樣口溫度270℃。按低標→樣品A→樣品B→高標的進樣次序進樣,要求相鄰兩次進樣的檢測結(jié)果相對標準偏差小于1%,否則需要再增加進樣次數(shù),直至滿足要求。1.4.2離子監(jiān)測電離方式為電子轟擊電離源(EI),電離能量70eV。離子源溫度250℃,傳輸線溫度:270℃,溶劑延遲3min。儀器分辯率1000;發(fā)射電流0.2mA;采集方式SIM(選擇離子監(jiān)測);掃描時間為20ms,間隔5ms,雙通道,m/z314和m/z319。1.5brhl1mserps1樣品中葡萄糖與標記葡萄糖的濃度比和響應峰面積比在兩個校正標準之間符合線性關(guān)系,血清中葡萄糖的質(zhì)量濃度可按括弧法計算C=[(Rs?R1)(Wh?W1)+W1]Mlab(Rh?R1)MserPs(1)C=[(Rs-R1)(Wh-W1)+W1]Μlab(Rh-R1)ΜserΡs(1)其中C為待測血清樣品中的葡萄糖質(zhì)量濃度,mg/kg;Rs、Rl、Rh分別為血清、低標、高標樣品中葡萄糖與標記葡萄糖的峰面積比;Wh、Wl分別為高標、低標樣品中葡萄糖與標記葡萄糖的質(zhì)量比;Mlab、Mser分別為加入血清樣品標記的、待測血清樣品中的葡萄糖的質(zhì)量,g;Ps為葡萄糖標準品的純度,99.8%;通過測定葡萄糖與標記葡萄糖的峰面積比,計算血清樣品中葡萄糖的準確含量。2結(jié)果與討論2.1血清樣品檢測圖1、圖2列出了血清樣品的選擇離子掃描色譜圖和質(zhì)譜圖,從圖1中可以看出,葡萄糖及同位素的保留時間為10.09min,響應約為1.01×105。表1、表2分別為取5瓶低標和6瓶高標血清樣品,每瓶取2個平行樣,每個樣進2針取平均值。測得低標、高標血糖濃度分別為1150mg/kg、1396mg/kg,即9.86mmol/L、11.97mmol/L,高于糖尿病所規(guī)定濃度下限(7.8mmol/L),即所測兩種樣品均為糖尿病人血清。2.2質(zhì)譜性能不穩(wěn)定測量結(jié)果的不確定度包括隨機因素和非隨機因素產(chǎn)生的不確定度,計算結(jié)果如表3所示。測量結(jié)果的不確定度,與如下因素有關(guān):(1)檢測儀器的性能,包括精密度、靈敏度、誤差。在實驗過程中,質(zhì)譜性能不穩(wěn)定常引起結(jié)果波動較大,主要體現(xiàn)在樣品瓶內(nèi)偏差呈增大趨勢,采用GC-ID/MS相對于LC-ID/MS更加穩(wěn)定。(2)樣品前處理過程復雜,化學衍生反應受多種因素影響。為準確檢測樣品中葡萄糖的含量,需確保樣品中的葡萄糖完全被衍生化。(3)加樣的準確性對數(shù)據(jù)的重復性有直接影響。實驗過程中,由于使用高精度的天平稱量樣品,加樣時使用電動移液器,重復性較好,減小了人為操作引起的