植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)二 葉綠素a、b含量測(cè)定

植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)二葉綠素a、b含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，α為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。實(shí)驗(yàn)原理各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和。今欲測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類(lèi)胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。實(shí)驗(yàn)原理葉綠素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波長(zhǎng)分別為665nm和649nm，類(lèi)胡蘿卜素為470nm，可據(jù)此得出以下公式:

色素濃度計(jì)算公式（濃度單位：mg·L-1）

Ca=13.95A665

–

6.88A649Cb=24.96A649

–

7.32A665CT=Ca+Cb=

18.08A649

+

6.63A665Cx.C=（1000A470–2.05Ca–114.8Cb）/245實(shí)驗(yàn)?zāi)康?；?shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備與試劑目的：掌握在未經(jīng)分離的葉綠體色素溶液中測(cè)定葉綠素a和b的方法及其計(jì)算；鞏固分光光度計(jì)的使用。材料：白蘭葉片儀器設(shè)備：

分光光度計(jì)，天平，研缽，容量瓶，漏斗，濾紙，滴管試劑：

95％乙醇，石英砂，碳酸鈣粉實(shí)驗(yàn)步驟1、取新鮮白蘭葉片，擦凈表面，去掉中脈，剪碎混勻。2、稱(chēng)取剪碎的新鮮樣品0.2g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3ml95％乙醇，研磨成均漿，再加95％乙醇10ml，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3～5min。3、取濾紙1張，置漏斗中，用95％乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到25ml容量瓶中，用少量95％乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分?。?shí)驗(yàn)步驟4、用滴管吸取95％乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。最后用95％乙醇定容至25ml，搖勻。5、把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95％乙醇為空白，在波長(zhǎng)665nm、649nm和470nm下測(cè)定吸光度（調(diào)節(jié)波長(zhǎng)旋鈕，選擇所需測(cè)的波長(zhǎng)。蓋上樣品室蓋，使光路通過(guò)參比溶液比色皿。將選擇開(kāi)關(guān)調(diào)至“A”，調(diào)節(jié)吸光度旋鈕，使數(shù)字顯示為“000.0”。再將被測(cè)溶液置于光路后，數(shù)字顯示值即為溶液的吸光度）。實(shí)驗(yàn)步驟吸光度色素濃度（mg·L-1）組織中各色素含量（mg·g-1）樣品質(zhì)量提取液總量A665A649A470CaCbCTCx·CCa'Cb'CT'Cx·C'Ca/Cb6、將上述數(shù)值填入書(shū)上表2-12-1中（不要求重復(fù)組）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算與分析1.將測(cè)定得到的吸光值代入下面的式子，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素的濃度(mg.L-1)以及葉綠素總濃度，葉綠素a/b的濃度比值。

Ca=13.95A665

–

6.88A649Cb=24.96A649

–

7.32A665CT=Ca+Cb=

18.08A649

+

6.63A665Cx.C

=（1000A470–2.05Ca–114.8Cb）/2452.最后根據(jù)下式可進(jìn)一步求出植物組織中葉綠素的含量：

色素的濃度(mg.L-1)×提取液體積(mL)（×稀釋倍數(shù)）樣品鮮重(g)×1000注意事項(xiàng)1、為了避免葉綠素的光分解，操作應(yīng)在弱光下進(jìn)行；研磨時(shí)間盡可能短些，以不超過(guò)兩分鐘為宜。2、過(guò)濾時(shí)必須將濾紙及葉片殘?jiān)粗翢o(wú)綠色為止。比色時(shí)提取液不能混濁。3、比色杯光學(xué)面保持清潔；換樣品時(shí)倒凈即可，不需潤(rùn)洗。4、樣品濃度控制在吸光度值0.2-0.8范圍之間進(jìn)行測(cè)定，如超出此范圍可適當(dāng)稀釋?zhuān)ɑ驖饪s）。5