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文檔簡介
植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)二葉綠素a、b含量測定實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見光譜的吸收,利用分光光度計(jì)在某一特定波長測定其吸光度,即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯—比爾定律,某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比,即A=αCL式中:α比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位,液層厚度為1cm時(shí),α為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。實(shí)驗(yàn)原理各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì),則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量,只需測定該提取液在三個(gè)特定波長下的吸光度A,并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。實(shí)驗(yàn)原理葉綠素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665nm和649nm,類胡蘿卜素為470nm,可據(jù)此得出以下公式:
色素濃度計(jì)算公式(濃度單位:mg·L-1)
Ca=13.95A665
–
6.88A649Cb=24.96A649
–
7.32A665CT=Ca+Cb=
18.08A649
+
6.63A665Cx.C=(1000A470–2.05Ca–114.8Cb)/245實(shí)驗(yàn)?zāi)康?;?shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備與試劑目的:掌握在未經(jīng)分離的葉綠體色素溶液中測定葉綠素a和b的方法及其計(jì)算;鞏固分光光度計(jì)的使用。材料:白蘭葉片儀器設(shè)備:
分光光度計(jì),天平,研缽,容量瓶,漏斗,濾紙,滴管試劑:
95%乙醇,石英砂,碳酸鈣粉實(shí)驗(yàn)步驟1、取新鮮白蘭葉片,擦凈表面,去掉中脈,剪碎混勻。2、稱取剪碎的新鮮樣品0.2g,放入研缽中,加少量石英砂和碳酸鈣粉及2~3ml95%乙醇,研磨成均漿,再加95%乙醇10ml,繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3~5min。3、取濾紙1張,置漏斗中,用95%乙醇濕潤,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,過濾到25ml容量瓶中,用少量95%乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次,最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分?。?shí)驗(yàn)步驟4、用滴管吸取95%乙醇,將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o綠色為止。最后用95%乙醇定容至25ml,搖勻。5、把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95%乙醇為空白,在波長665nm、649nm和470nm下測定吸光度(調(diào)節(jié)波長旋鈕,選擇所需測的波長。蓋上樣品室蓋,使光路通過參比溶液比色皿。將選擇開關(guān)調(diào)至“A”,調(diào)節(jié)吸光度旋鈕,使數(shù)字顯示為“000.0”。再將被測溶液置于光路后,數(shù)字顯示值即為溶液的吸光度)。實(shí)驗(yàn)步驟吸光度色素濃度(mg·L-1)組織中各色素含量(mg·g-1)樣品質(zhì)量提取液總量A665A649A470CaCbCTCx·CCa'Cb'CT'Cx·C'Ca/Cb6、將上述數(shù)值填入書上表2-12-1中(不要求重復(fù)組)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算與分析1.將測定得到的吸光值代入下面的式子,計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的濃度(mg.L-1)以及葉綠素總濃度,葉綠素a/b的濃度比值。
Ca=13.95A665
–
6.88A649Cb=24.96A649
–
7.32A665CT=Ca+Cb=
18.08A649
+
6.63A665Cx.C
=(1000A470–2.05Ca–114.8Cb)/2452.最后根據(jù)下式可進(jìn)一步求出植物組織中葉綠素的含量:
色素的濃度(mg.L-1)×提取液體積(mL)(×稀釋倍數(shù))樣品鮮重(g)×1000注意事項(xiàng)1、為了避免葉綠素的光分解,操作應(yīng)在弱光下進(jìn)行;研磨時(shí)間盡可能短些,以不超過兩分鐘為宜。2、過濾時(shí)必須將濾紙及葉片殘?jiān)粗翢o綠色為止。比色時(shí)提取液不能混濁。3、比色杯光學(xué)面保持清潔;換樣品時(shí)倒凈即可,不需潤洗。4、樣品濃度控制在吸光度值0.2-0.8范圍之間進(jìn)行測定,如超出此范圍可適當(dāng)稀釋(或濃縮)。5
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