抗原抗體反應(yīng)的研究進展

抗原抗體反應(yīng)的研究進展

抗過敏反應(yīng)是指抗過敏與相應(yīng)抗過應(yīng)劑之間的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)生于體內(nèi),也可發(fā)生于體外。體內(nèi)反應(yīng)可介導吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用;體外反應(yīng)則根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應(yīng)的介質(zhì)(例如電解質(zhì)、補體、固相載體等)不同,可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。1.1配合反應(yīng)階段抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于兩種分子間的結(jié)構(gòu)互補性與親和性,這兩種特性是由抗原與抗體分子的一級結(jié)構(gòu)決定的?？乖贵w反應(yīng)可分為兩個階段。第一為抗原與抗體反應(yīng)特異性結(jié)合的階段,此階段反應(yīng)快,僅需幾s至幾min,但不出現(xiàn)可見反應(yīng)。第二為可見反應(yīng)階段,抗原抗體復合物在環(huán)境因素(如電解質(zhì)、pH值、溫度、補體)的影響下,進一步交聯(lián)和聚集,表現(xiàn)為凝集、沉淀、溶解等肉眼可見的反應(yīng)。此階段反應(yīng)慢,往往需要數(shù)min至數(shù)h。實際上這兩個階段難以嚴格區(qū)分,而且兩階段的反應(yīng)所需時間亦受多種因素和反應(yīng)條件的影響,若反應(yīng)開始時抗原抗體濃度較大且兩者比較適合,則很快能形成可見反應(yīng)。1.2抗蟲活性的特點1.2.1蛋白質(zhì)的測定抗原抗體的結(jié)合使各自所帶的膠體電荷減少或消失,蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。此時,如再加入電解質(zhì),如NaCl,則進一步使疏水膠體物相互靠攏,形成可見的抗原抗體復合物。1.2.2抗體間的相互作用由電荷引力、范德華引力、、氫鍵結(jié)合力、疏水作用等有4種分子間引力參與并促進抗原抗體間的特異性結(jié)合。而疏水作用當抗原表位與抗體結(jié)合點靠近時,相互間正、負極性消失,由于靜電引力形成的親水層也立即失去,排斥了兩者之間的水分子,從而促進抗原與抗體間的相互吸引而結(jié)合。這種疏水結(jié)合對于抗原抗體的結(jié)合是很重要的,提供的作用力最大。1.3生物傳感器的應(yīng)用檢測抗體可用于評價人和動物免疫功能的指標,對有關(guān)疾病的診斷具有重要意義?？乖臋z測可分為4類:①各種微生物及其大分子產(chǎn)物,用于傳染病的診斷、微生物的分離及鑒定以及對菌苗疫苗的研究;②生物體中各種大分子,進行疾病的診斷;③人和動物細胞的表面分子,檢測這類抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究,對各種與免疫有關(guān)的疾病的診斷及發(fā)病機制的研究有重要意義;④各種半抗原物質(zhì),如某些藥物、激素等,對檢測病人服藥后血液中藥物濃度的檢測、服用違禁藥物的檢測等具有重要意義。目前,國內(nèi)外研究蛋白質(zhì)反應(yīng)的方法有很多,主要有以下幾類:(1)在原子水平研究蛋白質(zhì)的反應(yīng),這種方法得到與反應(yīng)有關(guān)的原子或殘余物特殊信息。常用的方法有X-射線晶體衍射技術(shù)。X-射線晶體衍射技術(shù)可以精細、直觀地表達出分子內(nèi)部各種基因的相互空間關(guān)系,檢測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。(2)直接分析反應(yīng),可以檢測到兩個特異性蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)。實驗方法有基于表面激元共振(SPR)的BIAcore分析儀、原子力顯微鏡(AFM)、光干涉反射儀(RIfS)和雙雜交(two-hybridexperiment)系統(tǒng)。SPR是一種光學現(xiàn)象,對接近金屬表面的介質(zhì)的光學性質(zhì)的改變很敏感,可以實時、定性和定量測定生物的特異性反應(yīng),廣泛用于動力學分析、生物分子的濃度檢測、涉及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的反應(yīng)、DNA—DNA的反應(yīng)、受體—配體反應(yīng)等的分子識別。AFM技術(shù)是近年來建立的一種研究固—液界面上生物分子結(jié)構(gòu)和功能的分析方法,已在絲狀蛋白結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)陣列和密集堆積的寡聚蛋白質(zhì)的成像以及測量特異分子間作用力等方面取得了較大的進展。Schwesinger等用AFM研究了抗體抗原復合物的吸附與解離,錢衛(wèi)平用AFM研究了anti—HSS的吸附及HBsAg和anti—HBs的相互作用,對一些重要的基礎(chǔ)問題從分子水平作出了解釋。RIfS生物傳感器利用可見光原理,通過動態(tài)檢測膜厚度變化來表征材料界面生物分子的富集量,具有免標記、精確、靈敏、可對生物大分子進行實時動態(tài)分析等特點,國內(nèi)外已開始進行生化、環(huán)保和臨床檢驗研究。酵母雙雜交技術(shù)問世不到10a,但已經(jīng)在蛋白質(zhì)間的相互作用研究、篩選新的蛋白質(zhì)、研究蛋白質(zhì)的功能等諸方面發(fā)揮重要作用,雙雜交系統(tǒng)是通過一個或幾個報告基因的轉(zhuǎn)錄活性來測定兩種蛋白質(zhì)之間的反應(yīng),這種方法反應(yīng)了蛋白質(zhì)的原始狀態(tài)。雙雜交系統(tǒng)已經(jīng)用于測定各種已知蛋白質(zhì)或多肽間的反應(yīng),也用于尋找一個給定蛋白質(zhì)(誘餌)的未知的獵物蛋白。但是,雙雜交技術(shù)的應(yīng)用受到很多限制,如轉(zhuǎn)錄激活的可靠性,誘餌和獵物蛋白可能具有自身激活轉(zhuǎn)錄的能力,酵母中一些類型的后轉(zhuǎn)錄修飾的缺失等,造成通過雙雜交觀察到的蛋白質(zhì)的相互作用在真實情況下不一定發(fā)生,也即所謂的假陽性;假陰性現(xiàn)象也是雙雜交分析過程中經(jīng)常碰到的問題;一些對細胞致命的蛋白質(zhì)也不適宜通過雙雜交系統(tǒng)來分析。(3)蛋白質(zhì)復合物的檢測,可以檢測出在給定的時間蛋白質(zhì)復合物中有哪些蛋白質(zhì),但不能給出反應(yīng)的化學詳情。實驗方法有免疫沉淀、質(zhì)譜分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分析等。免疫沉淀是使用最簡單、應(yīng)用最廣泛的用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)反應(yīng)的技術(shù),利用特異性抗體進行免疫沉淀可以檢測特異性抗原與任何其它蛋白質(zhì)分子的相互作用。放射性標記蛋白質(zhì)的免疫沉淀是尋找新的蛋白質(zhì)相互作用的一種有效方法。免疫印跡將疑膠電泳的分辨力和免疫化學檢測的特異性融為一體,該方法具有高效、簡便、靈敏等特點。質(zhì)譜技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最快,也最具活力和潛力的技術(shù)。它通過測定蛋白質(zhì)的質(zhì)量來判別蛋白質(zhì)的種類。當前蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)就是雙向凝膠電泳—質(zhì)譜技術(shù),即通過雙向凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離,然后利用質(zhì)譜對蛋白質(zhì)逐一進行鑒定。對于蛋白質(zhì)鑒定而言,高通量、高靈敏度和高精度是3個關(guān)鍵指標。一般的質(zhì)譜技術(shù)難以將三者合一,而最近發(fā)展的質(zhì)譜技術(shù)可以同時達到以上3個要求,從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)準確和大規(guī)模的鑒定。ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性,又保留酶的活性。在測定時,受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測定方法達到很高的敏感度。(4)在細胞水平進行分析一活體生物分析,受體—配體反應(yīng)刺激細胞的增殖分析,這種方法不能得到反應(yīng)的確切特征,但是所得到的生物學信息可以給出對于一個特定反應(yīng)潛能的推論。蛋白剪切技術(shù)提供了活細胞中蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)反應(yīng)的識別和定性的推理的方法,補充了傳統(tǒng)雙雜交途徑的限制和遺留問題,并可用于廣泛的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)反應(yīng)的研究。(5)高通量分析。大規(guī)模的蛋白質(zhì)反應(yīng)分析可以用類似于基因芯片的方法,用蛋白質(zhì)芯片來完成?；诳贵w的微陣列的概念是在20世紀80年代中后期由Ekins和Chu提出的,他們證明了基于抗體的微陣列可以高靈敏度地同時分析多種蛋白質(zhì)水平。之后,Genometrix的研究人員進一步說明了以高通量形式測定多種IgG的可能性。隨著蛋白質(zhì)陣列技術(shù)的進一步發(fā)展,很多小組也報道了應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片篩選抗體—抗原的反應(yīng),研究蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用,分析酵母激酶,檢測自身免疫抗體等。蛋白質(zhì)芯片是指固定于支持介質(zhì)上的蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列,又稱蛋白質(zhì)微陣列(Proteinmicroarray),最早是在生物功能基因組學研究中繼基因芯片之后,作為基因芯片功能的補充發(fā)展起來的。蛋白質(zhì)芯片與基因芯片類似,是在一個基因芯片大小的載體上,按使用目的的不同,在固相載體上點布相同或不同種類的蛋白質(zhì),然后再用標記了熒光染料的蛋白質(zhì)結(jié)合,掃描儀上讀出熒光強弱,計算機分析出樣本結(jié)果。從理論上講,蛋白質(zhì)芯片可以對各種蛋白質(zhì)、抗體以及配體進行檢測,彌補基因芯片檢測的不足,該方法不僅適合于抗原、抗體的篩選,同樣也可用于受體配體的相互作用的研究,具有一次性檢測樣本巨大、相對低消耗、計算機自動分析結(jié)果以及快速、準確等特點。最早進行蛋白質(zhì)芯片研究的是德國科學家Lueking。Lueking等將已知的92種不同種類的人體蛋白點印在PVDF膜上,制成蛋白質(zhì)微陣列,并將抗體與該芯片進行孵育反應(yīng),再將辣根過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體與芯片抗體復合物反應(yīng),通過顯色反應(yīng)檢測抗體的存在情況,對抗體進行篩選。此后又對蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用進行了很多研究,主要包括以下幾個方面:3.1菌株單克隆抗體抗原抗體的特異性識別和結(jié)合是目前蛋白質(zhì)芯片檢測利用最廣泛的生物分子相互作用,單克隆抗體是蛋白質(zhì)芯片檢測中使用最廣泛的生物分子。將抗體/抗原點樣到玻片上構(gòu)成蛋白質(zhì)陣列,用對應(yīng)的抗原/抗體的熒光標記混合物與蛋白質(zhì)芯片雜交,可以研究抗原/抗體結(jié)合的特異性、蛋白質(zhì)芯片對樣品中目標蛋白質(zhì)的定量能力和檢測的靈敏度。3.2無效和外源蛋白質(zhì)酵母雙雜交系統(tǒng)是近年來基因組規(guī)模上研究蛋白質(zhì)相互作用的主要方法,但存在體內(nèi)操作、假陽性、假陰性和外源蛋白質(zhì)正確折疊、修飾等局限。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)不依靠任何生物有機體而在體外直接檢測目標蛋白質(zhì),實驗條件可隨意控制,同時實驗步驟自動化程度高,一次分析的蛋白質(zhì)數(shù)量大,因而成為目前除酵母雙雜交系統(tǒng)外進行大規(guī)模研究蛋白質(zhì)相互作用的主要方法,是研究蛋白質(zhì)相互作用的理想平臺。3.3酪氨酸磷酸化酶蛋白質(zhì)芯片可作為高通量篩選酶—底物作用的良好平臺。Zhu等用蛋白質(zhì)芯片,研究了酶與底物蛋白的反應(yīng),不僅發(fā)現(xiàn)許多新的酶作用活性,而且發(fā)現(xiàn)大部分蛋白激酶能夠?qū)⒗野彼崃姿峄?研究還表明這種底物蛋白質(zhì)芯片用于酶—底物作用分析時,在信噪比、靈敏性和酶用量方面都比常規(guī)384微孔板優(yōu)越。MacBeath等將Kemptide、I—2和Elk13種底物蛋白點樣到玻片上制成蛋白質(zhì)芯片,分別用PKA、CKⅡ和EK2等3種蛋白激酶與芯片雜交,結(jié)果表明芯片蛋白質(zhì)底物非常特異地分析蛋白激酶磷酸化。3.4雙鏈dna芯片蛋白質(zhì)與核酸的相互作用在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。最常用的研究方法是凝膠遷移實驗,但這種方法難以高通量篩選順式作用元件和反式作用因子的相互作用。一種高通量研究DNA結(jié)合蛋白的方法——雙鏈DNA芯片還處于探索階段。Ge等研究了運用蛋白質(zhì)芯片檢測蛋白質(zhì)與核酸相互作用的可行性,結(jié)果證明蛋白質(zhì)芯片上的所有蛋白質(zhì)都能夠不同程度地特異識別和結(jié)合雙鏈和單鏈寡核苷酸片段,說明大多數(shù)DNA結(jié)合蛋白能夠既能和雙鏈DNA結(jié)合,也能夠和單鏈DNA結(jié)合;蛋白質(zhì)陣列與RNA的作用研究表明,蛋白質(zhì)陣列能夠成功地分析RNA與蛋白質(zhì)間的識別性結(jié)合。因此蛋白質(zhì)芯片能成為一種進行高通量蛋白質(zhì)與DNA或RNA作用篩選的有效方法。3.5蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用Ge等將包括通用轉(zhuǎn)錄因子、激活蛋白和輔激活蛋白的48種純化蛋白質(zhì)點樣在硝酸纖維素膜制成通用蛋白質(zhì)陣列,用125I標記的三碘甲狀腺原氨酸(T3)雜交來研究小分子化學配體與陣列蛋白質(zhì)間的相互作用,結(jié)果表明在48個蛋白質(zhì)中只有重組甲狀腺激素受體與125I—T3特異性結(jié)合。研究說明運用蛋白質(zhì)芯片可以高通量篩選蛋白質(zhì)—配體結(jié)合反應(yīng),識別配體的作用蛋白和確定蛋白質(zhì)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這種方法可推廣到蛋白質(zhì)與藥物小分子相互作用的研究中,借助蛋白質(zhì)芯片篩選新藥靶標,對加速藥物發(fā)現(xiàn)具有非常重要的意義。3.6蛋白芯片檢測用蛋白質(zhì)芯片可以繪制正常人和疾病患者體內(nèi)的蛋白質(zhì)圖譜,通過對兩者的比較找到在疾病中特異表達的蛋白質(zhì),然后將這些疾病中特異表達的蛋白質(zhì)制成芯片,為癌癥和其它傳染性疾病等的診斷提供一種方法。FungE.等人已將蛋白質(zhì)芯片用于對癌癥的研究。由于蛋白質(zhì)芯片