槐米中蘆丁和槲皮素含量測定方法的研究進(jìn)展

槐米中蘆丁和槲皮素含量測定方法的研究進(jìn)展

蝗蟲大米中最有效的活性物質(zhì)是黃酮類化合物，如甘蔗和木維素。蘆丁具有廣泛的藥理活性,能維持及恢復(fù)毛細(xì)管的正常彈性,增強(qiáng)其抵抗力,防止血細(xì)胞凝聚,臨床用于防治腦溢血、高血壓等心腦血管疾病;槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗菌、抗病毒等多方面的藥理作用。我國是蘆丁的出口國,槐米是提取蘆丁的主要原料,2005版《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定,槐米中總黃酮的含量(以無水蘆丁計)不低于20%,無水蘆丁(C27H30O16)不少于15%。因此,研究槐米中蘆丁和槲皮素含量測定方法對槐米質(zhì)量控制有很重要的意義?，F(xiàn)將槐米中蘆丁和槲皮素的含量測定方法綜述如下。1分光光度法1.1蘆丁、槲皮素含量測定及其分配的回歸方程李氏等用等吸收紫外光度法同時測定槐米中的蘆丁和槲皮素。分別配制槲皮素和蘆丁的單組分標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定它們在波長240~380nm的吸光度,經(jīng)過粗選和細(xì)選,分別找出槲皮素和蘆丁的等吸收波長λ1247、λ2266、λ3340、λ4370。然后分別配制一系列濃度的蘆丁、槲皮素溶液,測定其在波長247nm和266nm、波長340nm和370nm處的吸光度,計算其對應(yīng)的吸光度差值,分別作出ΔA-C校準(zhǔn)曲線及線性回歸方程。用上述方法測定槐米中蘆丁和槲皮素的含量。將槐米的乙醇提取物配制成一系列不同濃度的甲醇溶液,在波長247nm和266nm、340nm和370nm下分別測定其吸光度值,并計算吸光度差值,據(jù)回歸方程計算蘆丁和槲皮素的濃度。然后分別計算樣品中蘆丁和槲皮素的含量,6個樣品中蘆丁平均含量為80.60%,RSD=1.61%;槲皮素平均含量為9.49%,RSD=1.53%。1.2工作曲線的繪制和測定利用鋁與槲皮素形成熒光配合物,姚氏等采用熒光光度法測定槲皮素。文獻(xiàn)中選擇測定條件為激發(fā)波長365nm,發(fā)射波長498nm,測定溫度為室溫,溶液酸度控制為pH=6,選用2×102mol/L鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液。在10mL比色管中,加入一定量的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液,再加入三氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)液1mL,用95%乙醇稀釋至刻度,振搖均勻后放置15min,用1cm比色皿,在960型熒光光度計上測其熒光強(qiáng)度,同時做空白試驗,繪制工作曲線。將槐米乙醇提取物用蒸餾水溶解,過聚酰胺柱,待水解液過完后,再用蒸餾水洗柱3次,用95%乙醇洗柱,洗至醇洗液加三氯化鋁無熒光反應(yīng)。合并乙醇洗液,測其中樣品的含量。方法加標(biāo)回收率97.8%~100.0%,RSD=2.58%(n=6)。1.3非催化體系活性物質(zhì)的合成在鹽酸介質(zhì)中,微量蘆丁對重鉻酸鉀氧化靛紅的反應(yīng)有明顯的催化作用,崔氏等建立了測定蘆丁的催化動力學(xué)光度法。取2只10mL具塞刻度試管,其中一只加入一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液,另一只不加,再分別依次加入0.60mL0.10%靛紅溶液、0.90mL0.30mol/L鹽酸溶液、1.10mL0.010mol/LK2Cr2O7溶液,然后加水至刻度,搖勻,反應(yīng)10min后,以水為參比,用1cm比色皿于611nm波長處測量非催化體系的吸光度A0和催化體系的吸光度A并計算ΔA。將槐米乙醇提取液按實驗方法進(jìn)行測定,同時做標(biāo)準(zhǔn)加入回收實驗。方法的線性范圍是0.003~0.09μg/mL和0.10~100μg/mL,檢出限為0.003μg/mL,回收率為95.5%~102.5%(n=4)。1.4樣品前處理與測定李氏等采用固相萃取-分光光度法聯(lián)用來測定中藥槐米中蘆丁含量。準(zhǔn)確配制不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,用移液管準(zhǔn)確量取溶液置于100mL量瓶中,加甲醇至5mL體積,加0.30mL5%NaN02溶液,放置6min;再加0.30mL10%Al(NO3)3溶液,放置6min;再加4.00mL4%NaOH溶液,最后加甲醇至刻度,搖勻。室溫放置15min后,在紫外分光光度計上于λ=500nm處測定吸光度,處理數(shù)據(jù)得回歸方程。樣品測試:先用5mL石油醚洗柱,再用5mL甲醇洗柱,最后加水5mL洗柱;加槐米甲醇提取溶液上柱,每2mL為單位收集流出液。UV測定:以第7~8mL流出液測試并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得原藥材樣品中蘆丁的含量為29.1%。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液及原藥材樣品液定量混合后依上法進(jìn)行分析,平均回收率為99.98%,RSD=0.012%(n=3)。1.5模擬樣品測定和回收率王氏等采用卡爾曼濾波光度法同時測定槐米中蘆丁和槲皮素含量。準(zhǔn)確配制蘆丁、槲皮素甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液2個系列(每個系列3~5個)溶液。取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,在230~300nm范圍內(nèi),每間隔2nm測其吸光度,數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸處理,求出各自的吸光系數(shù)。取蘆丁、槲皮素濃度一定的模擬樣品分別測定5次,計算RSD分別為2.54%和1.54%。取已知含量的模擬樣品6個,加入蘆丁、槲皮素適量,測定其含量,方法的平均回收率分別為:蘆丁99.1%(n=6,RSD=1.58%),槲皮素99.2%(n=6,RSD=1.98%)?；泵滋崛∥镏刑J丁和槲皮素的測定:準(zhǔn)確稱取一定量樣品,用甲醇提取后,以上述方法測得蘆丁含量為82.32%,RSD=0.45%,槲皮素含量為9.59%,RSD=1.2%(n=3)。1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限張氏等利用在稀硫酸介質(zhì)中,微量蘆丁對高碘酸鉀氧化玫瑰桃紅R褪色反應(yīng)有明顯的阻抑作用,據(jù)此建立了測定微量蘆丁的動力學(xué)光度法。取2支10mL具塞刻度試管,分別加入0、0.4mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,再分別依次加入3mol/LH2SO41.0mL、0.5g/L玫瑰桃紅R溶液1.0mL、0.01mol/L的KIO4溶液0.7mL,加水稀釋至刻度,混勻。在(94±0.1)℃恒溫水浴加熱反應(yīng)4min后,迅速啟開管塞用流水冷卻4min,以水為參比,用1cm吸收皿在分光光度計上于521nm波長處測量褪色體系的吸光度A0和阻抑褪色體系的吸光度A,計算ΔA=A-A0的值。分別移取不同量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于一批10mL具塞刻度試管中,按實驗方法操作,根據(jù)所得結(jié)果繪制工作曲線,蘆丁質(zhì)量濃度在0.02~0.4μg/mL范圍內(nèi)與ΔA呈線性關(guān)系,得線性回歸方程;對空白溶液進(jìn)行11次平行實驗測定,按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算出檢出限為5.0×10-9g/mL。將槐米乙醇提取液按實驗方法進(jìn)行測定,同時做標(biāo)準(zhǔn)加入回收實驗,回收率95.5%,RSD=2.8%(n=4)。1.7熒光強(qiáng)度法檢測傅氏等采用薄層色譜-化學(xué)衍生熒光分光光度法測定槐米中蘆丁的含量。實驗方法是以95%乙醇為溶劑進(jìn)行索氏提取,用醋酸乙酯-甲酸-水(4∶1∶1)為展開劑分離,洗脫后以10%AlCl3甲醇溶液作為反應(yīng)試劑,在激發(fā)波長420nm、發(fā)射波長513nm處測定熒光強(qiáng)度。結(jié)果此方法的線性范圍為0.2~1.2μg/mL,平均回收率為98.7%,RSD=2.71%,利用外標(biāo)兩點法計算樣品中蘆丁的含量。測定5份槐米市售樣品中蘆丁的含量,得槐米原藥材中蘆丁的含量為21.33%,RSD%=3.78%。2液體層析成像法2.1外標(biāo)法提取蘆丁鄧氏等用高效液相色譜法來檢測槐米中蘆丁的含量。色譜條件:分析柱為Nova-PakC18柱(150mm×4.6mm),流動相為甲醇-水(35∶65,v/v),應(yīng)用前經(jīng)0.45μm的過濾膜,超聲脫氣,流速為1.0mL/min,AUFS0.05,進(jìn)樣量為10μL,柱溫為30℃,檢測波長為261nm?；泵子靡掖继崛?以外標(biāo)法定量,測得槐米中蘆丁的含量為22.67%,平均回收率>96.32%(n=5)。此法對蘆丁的最低檢測濃度為0.5μg/mL,最低檢測限(10μL)5ng。2005年版《中華人民共和國藥典》中蘆丁的測定方法采用高效液相色譜法。色譜條件:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相:甲醇-1%冰醋酸(32∶68);檢測波長:257nm;進(jìn)樣量10μL,理論塔板數(shù)不低于2000。樣品用甲醇超聲提取,甲醇定容,干燥槐米中蘆丁含量不得少于15.0%。2.2樣品含量測定程氏等采用反相高效液相色譜法來測定。色譜柱:HP-HEWLETTODS(125mm×3.0mm,3μm)反相柱;流動相:乙腈-四氫呋喃-0.2%枸椽酸溶液(14∶1∶85);流速:0.4mL/min;檢測波長:360nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:5μL。用標(biāo)準(zhǔn)加入法測得蘆丁、槲皮素平均回收率分別為99.75%(RSD=0.57%)和99.42%(RSD=1.19%,n=5)?；泵子眉状汲曁崛?測得槐米樣品中蘆丁含量24.46%,RSD=0.18%,槲皮素含量1.41%,RSD=2.0%(n=3)。朱氏等測定了槐米中槲皮素的含量。采用的色譜條件:Shim-PackCLC-ODS(150mm×6.0mm,5μm)色譜柱;室溫;流動相:甲醇-水(用乙酸調(diào)pH值為3.3)為55∶45(V/V);流速:1.0mL/min;檢測波長370nm;進(jìn)樣量20μL?；泵子眉状继崛?根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得粗制品中槲皮素平均含量為812.0μg/mg,得精制品中槲皮素平均含量為908.0μg/mg,槐米中槲皮素的含量為59.8mg/g。平均回收率99.98%±2.71%,RSD=2.71%(n=4)。使用與文獻(xiàn)一樣的色譜柱,徐氏等測定了槐米中槲皮素的含量。色譜條件:流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(7∶3);流速為0.8mL/min;檢測波長為375nm;柱溫為30℃;進(jìn)樣量為5μL。該方法的線性范圍為10.03~100.3ng,r=0.9997;平均回收率為99.06%,RSD=2.07%(n=9)?；泵子眉状见}酸回流提取,測定分析了4批樣品中槲皮素的含量分別為12.62%(RSD=0.66%)、9.66%(RSD=1.07%)、9.13%(RSD=O.74%)、11.19%(RSD=O.42%)(n=3)。2.3工作電位周氏等探討了毛細(xì)管電泳法測定槐米中槲皮素和蘆丁的含量。背景緩沖液為30mmol/L硼砂溶液(pH=9.0),3000Pa壓力下進(jìn)樣30ms,分析電壓20kV,254nm檢測,溫度25℃。將干燥的槐米微波萃取后,測得槐米中槲皮素含量3.0mg/g(RSD=2.1%,n=5),蘆丁含量211.0mg/g(RSD=1.6%,n=5)。張氏等自制微型碳糊電極,采用高效毛細(xì)管電泳-安培檢測法對蘆丁水解常數(shù)進(jìn)行了研究,并用于蘆丁和槲皮素的檢測。在恒溫杯中注入蘆丁溶液;另將裝有鹽酸溶液的容量瓶同時置于恒溫槽中。15min后,迅速將鹽酸溶液傾入恒溫杯中并加以攪拌,同時記錄時間。然后每隔相應(yīng)的時間,移取1.0mL上述水解混合液,迅速加入9.0mL20mmol/L磷酸鈉(pH=8.0)溶液,冷卻,以終止水解反應(yīng),并記錄水解時間。電泳分離條件:電泳液的酸度為pH=8.0的磷酸鹽緩沖液(20mmol/L),分離電壓為15V,電動進(jìn)樣時間為10s。末端檢測,工作電位+1000mV,檢測限分別為0.6mg/L和2.0mg/L,平均回收率97.6%。陳氏等使用自組裝的毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(CE-ED)裝置,電化學(xué)檢測池為三電極體系:碳圓盤電極為工作電極,飽和甘汞電極(SCE)為參比電極,鉑絲為輔助電極。通過三維定位調(diào)節(jié)器使工作電極與毛細(xì)管出口在一條直線上,并盡可能靠近毛細(xì)管末端。采用電動進(jìn)樣,條件為在12kV下從毛細(xì)管陽極端進(jìn)樣6s,檢測池為陰極電泳槽。100mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH9.0)為運行緩沖液。在槐米樣品溶液中準(zhǔn)確加入蘆丁和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)溶液,5次測得平均回收率為97.89%(蘆丁)和96.83%(槲皮素),RSD分別為2.06%和2.42%。李氏等自組裝CE-ED,同樣使用電化學(xué)檢測方法,用Ag/AgCl做參比電極,鉑絲為輔助電極。掃描時間2min,電壓-0.5~1.5V,工作電位100mV,測定時間3min。電泳測定的最佳條件:測定電位1.2V,分離電壓12kV,15kV下進(jìn)樣5s,緩沖液為20mmol/L含40mmol/LSDS和10%乙腈的硼酸鹽溶液(pH=8.8)。蘆丁和槲皮素的最低檢測下限分別為0.001mg/mL和0.0005mg/mL,樣品中兩物質(zhì)含量分別為3.63%和2.59%。QingcuiChu等的電泳條件及檢測方法與文獻(xiàn)基本一致。樣品處理:分別稱取大約2g生槐米和炒制槐米,研碎后精密稱取,然后用10mL無水乙醇-水(4∶1)混合溶液超聲提取30min,過濾后測定。蘆丁和槲皮素的檢測下限分別為2.0×10-7、2.8×10-7g/mL,RSD分別為2.3%、2.2%。3供試品的測定王氏用薄層掃描法來測定槐米中蘆丁含量。自制薄層板(硅膠G-硼酸-枸櫞酸=100∶0.9∶0.3;用0.3%CMC-Na水溶液濕法鋪板;10cm×20cm,厚0.5mm),展開劑為乙酸乙酯-丁酮-正丁醇-甲酸-水(10∶6∶1∶2∶2),檢測波長為360nm,單波長鋸齒掃描,狹縫0.2mm×0.3mm,Sx=5。槐米用甲醇提取,外標(biāo)兩點法測定供試品中蘆丁的平均含量,為25.75%,RSD=1.05%(n=3)。平均加樣回收率為98.52%,RSD=1.76%(n=5)。4電壓法4.1還原波的測定馬氏等采用單掃示波極譜法測定槐米中蘆丁含量。pH=3.5的0.1mol/LNaAc-HAc溶液為底液,分別取不同量的1.0mol/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中,加支持電解液至刻度,搖勻。在JP3-1型示波極譜儀上單掃記錄二階導(dǎo)數(shù)還原波。掃描電位:-1.10~-1.60V。樣品中蘆丁的測定:槐米加乙醇回流提取后,然后將提取液于10mL電解杯中,加入10mLpH=3.5的0.1mol/LNaAc-HAc溶液,用單掃示波極譜法測定。結(jié)果槐米中蘆丁含量為21.41%±0.16%(n=6),RSD=0.74%。4.2玻璃電極的制備Jing-LinHe等測定原理基于β-環(huán)糊精對蘆丁的作用,采用β-環(huán)糊精膜電極為工作電極,用循環(huán)伏安法測定了槐米中蘆丁的含量。膜電極的制作:將2mg的多壁碳納米管(MWNT)和1mLβ-環(huán)糊精混合,超聲攪拌,得2mg/mL的黑色懸浮物;將玻璃電極刨光后,分別用蒸溜水和乙醇超聲清洗2次,然后將6μL上述懸浮物滴到玻璃電極上,在室溫下,空氣中干燥24h。測定方法:將電極插入含蘆丁的0.1mol/L磷酸緩沖溶液(pH3.0)中攪拌4min,工作電位+0.8~0.1V,掃描速度20mV/s,檢測下限為2.0×10-7mol/L。5測試方法陳氏等H-point法在灰色體系中的應(yīng)用,利用標(biāo)準(zhǔn)加入系列光譜數(shù)據(jù)測定了槐米中蘆丁的含量。掃描區(qū)間200~450nm,速度為10nm/min,狹縫寬度為2nm。測定方法:精密量取不同體積的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別置于25mL不同量瓶中,加入樣品1.0mL,并加水至刻度,搖勻,在200~450nm掃描