24-表油菜素內(nèi)酯對低氧脅迫下黃瓜抗氧化系統(tǒng)及無呼吸酶活性的影響

24-表油菜素內(nèi)酯對低氧脅迫下黃瓜抗氧化系統(tǒng)及無呼吸酶活性的影響

氧氣是細(xì)胞膜上電子傳播的最后一個受體，它促進了細(xì)胞的循環(huán)，維持了細(xì)胞生長所需的恢復(fù)力，構(gòu)成了整個植物生命代謝的核心。低氧脅迫下，植株線粒體片層出現(xiàn)不可逆的結(jié)構(gòu)變化，體內(nèi)有氧呼吸受阻、活性氧代謝平衡遭到破壞，體內(nèi)活性氧積累。植物細(xì)胞在感受到厭氧信號后，啟動抗氧化機制及無氧呼吸系統(tǒng)，以維持個體存活(王文泉和張福鎖2001)。油菜素內(nèi)酯(BR)是廣泛存在于植物中的類似于動物和昆蟲甾醇類激素的一種天然產(chǎn)物，可促進植物DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，提高酶(如ATP酶，蔗糖酶)活性，以及參與其它植物體許多生理過程，增強植株對生物和非生物脅迫的抗性(Sasse2003)。O2可參與植物體內(nèi)調(diào)節(jié)BR的合成和代謝過程，影響體內(nèi)BR的濃度和生理功能(Cervantes2001)。Neff等(1999)分離到一種加強植物對BR反應(yīng)的基因CYP72B1，反向遺傳學(xué)研究表明，這一基因通過對BR活性水平的調(diào)節(jié)而調(diào)控植物對環(huán)境變化的反應(yīng)，因而BR可能是一種提高植物適應(yīng)環(huán)境變化的可塑性的促進型激素。研究表明，BR可通過誘導(dǎo)體內(nèi)抗氧化酶的變化而增強逆境脅迫下植株的耐性(Krishna2003)。低氧脅迫下植物體的能量供應(yīng)減少，植株通過緩慢生長以節(jié)約能量和物質(zhì)消耗，或設(shè)法改善供氧狀況維持正常呼吸以獲得能量，這一作用由激素調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥油菜素內(nèi)酯缺失體(det2)形態(tài)類似于低氧脅迫下野生型擬南芥表現(xiàn)型，對低氧脅迫不敏感，外源添加油菜素內(nèi)酯可以緩解低氧對作物發(fā)育的影響(Ramonell等2001;Cervantes2001)。但是，BR對根際低氧脅迫下植物ROS及無氧呼吸代謝的影響未見報告。為此，作者以耐低氧性具有明顯差異的2個黃瓜品種為試材，采用營養(yǎng)液水培，研究了外源24-表油菜素內(nèi)酯(EBR)處理對低氧脅迫下黃瓜幼苗根系活性氧含量、抗氧化酶及無氧呼吸酶活性的影響，探討EBR在黃瓜根際低氧脅迫下的生理調(diào)節(jié)作用。1材料和方法1.1育苗期的處理以篩選出的抗低氧性較強的‘綠霸春四號’(廣東省農(nóng)科院提供)和抗低氧性較弱的‘中農(nóng)八號’(中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所提供)黃瓜(CucumissativusL.)品種(馬月花和郭世榮2004)為材料。種子經(jīng)過消毒、催芽后，播于裝有石英砂的塑料盤中，于晝/夜溫度為27～30℃/16～18℃的溫室內(nèi)育苗。子葉展平后每2d澆灌一次1/2Hoagland營養(yǎng)液。當(dāng)幼苗二葉一心時，選取整齊一致的幼苗定植于裝有1/2Hoagland營養(yǎng)液(pH6.3±0.1)的水槽中，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)幼苗三葉一心時，將2個品種幼苗各分成4部分，每部分各18株進行下列處理：(A)對照，用氣泵正常通入空氣(40min/h)，維持營養(yǎng)液溶氧濃度(DO)為8.0mg/L左右；(B)對照+EBR10-3mg/L(營養(yǎng)液添加);(C)低氧處理，用溶氧濃度調(diào)節(jié)儀(昆騰，美國生產(chǎn))控制營養(yǎng)液DO值為0.9～1.1mg/L；(D)低氧+EBR10-3mg/L(營養(yǎng)液添加)。處理后0、2、4、6、8d分別取幼苗根系中部進行各項指標(biāo)的測定，試驗重復(fù)3次，所得結(jié)果用SAS軟件Duncan’s多重比較法進行統(tǒng)計分析。1.2過氧化物酶pod活性測定超氧化物歧化酶(SOD)活性采用Giannopolitis和Ries(1977)的方法測定，以一定時間抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光還原50%為一個酶活性單位(U，即μmol/min);過氧化物酶(POD)活性測定按照曾韶西等(1997)的方法進行，以O(shè)D470每分鐘增加1為一個酶活性單位(U);過氧化氫酶(CAT)活性按照Aebi(1984)的方法測定，以使OD240每分鐘減少0.1為一個活性單位(U)。酶的活性均以U/mg蛋白表示。1.3過氧化氫2.2含量測定超氧陰離子(O2-·?)產(chǎn)生速率按照王愛國和羅廣華(1990)的方法測定；過氧化氫(H2O2)含量按照Uchida等(2002)的方法測定；丙二醛(MDA)含量按照Hodges等(1999)的方法測定。1.4酶活性的測定按照Mustroph和Albrecht(2003)的方法提取酶液，乳酸脫氫酶(LDH)活性測定按照Vassault(1983)的方法，乙醇脫氫酶(ADH)和丙酮酸脫羧酶(PDC)活性測定按照Waters等(1991)的方法，測定OD340的降低速率，以每分鐘底物減少1μmoL為一個酶活性單位(U)，酶活性以U/mg蛋白表示。蛋白質(zhì)含量測定按Bradford(1976)的方法進行。1.5幼苗根系計數(shù)在處理8d時用臺式掃描儀(EPSONEXPERS-SION1680)將幼苗根系圖像掃描存入電腦，再用圖像分析軟件WinRHIZO(加拿大RegentInstruments公司)計算總根長、總根表面積、總根體積、平均根直徑和總根尖數(shù)。每項指標(biāo)測定為15次重復(fù)。每處理取樣15株，取其平均值。2結(jié)果2.1ebr對黃瓜根系生長的影響各處理黃瓜根系生長狀況見圖1。從圖1、圖2可以看出，正常通氣條件下，EBR處理對黃瓜根系的生長無明顯影響；根際低氧脅迫抑制了黃瓜根系的生長，根的總長、總表面積、總體積以及總根尖數(shù)均比對照有顯著的下降；EBR處理后‘綠霸春四號’和‘中農(nóng)八號’幼苗根系總長、總表面積，‘中農(nóng)八號’幼苗根系總根尖數(shù)顯著提高，‘綠霸春四號’幼苗根系總根尖數(shù)無明顯變化。低氧脅迫下，抗低氧能力較強的‘綠霸春四號’根的總長、總表面積、總體積以及總根尖數(shù)降低幅度均低于抗低氧能力較弱的‘中農(nóng)八號’。2.2ebr處理對低氧脅迫下植株生長指標(biāo)的影響如圖3所示，試驗期間對照區(qū)植株根系內(nèi)O2-·?產(chǎn)生速率、H2O2及MDA含量無明顯變化；通氣條件下，EBR處理降低了MDA、H2O2及O2-·?含量，但影響均不明顯；低氧脅迫下，2個品種幼苗根系O2-·?產(chǎn)生速率、H2O2及MDA含量明顯提高，顯著高于對照，且抗低氧能力較弱的‘中農(nóng)八號’提高幅度大于抗低氧能力較強的‘綠霸春四號’，O2-·?產(chǎn)生速率各處理約在6d時達(dá)到最大值，H2O2含量單純低氧脅迫約在處理4d時達(dá)到峰值，其余處理約為2d,MDA含量‘中農(nóng)八號’單純低氧脅迫在處理約4d時達(dá)到峰值，其余處理MDA含量在約2d時達(dá)最大值；EBR處理顯著降低了低氧脅迫下植株體內(nèi)O2-·?產(chǎn)生速率、H2O2及MDA含量。相同的條件下，抗低氧能力較強的‘綠霸春四號’根組織O2-·?產(chǎn)生速率、H2O2及MDA含量均低于抗低氧能力較弱的‘中農(nóng)八號’。2.3低氧脅迫對幼苗根系抗氧化酶活性的影響從圖4可以看出，對照區(qū)植株根系內(nèi)SOD、POD及CAT活性在整個試驗期間相對穩(wěn)定；通氣條件下，EBR抑制了SOD活性，提高了POD活性，但是差異均不顯著；低氧脅迫下，2個品種幼苗根組織SOD、POD及CAT活性升高，隨處理時間的延長均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，試驗期間均高于對照。低氧脅迫下，SOD、CAT活性各處理約在2d時達(dá)到最大值；POD活性單純低氧脅迫處理約在6d時達(dá)到峰值，EBR處理約在4d時達(dá)到峰值。EBR處理顯著提高了低氧脅迫下幼苗根系SOD、POD活性，對CAT活性無明顯影響。相同條件下，抗低氧能力較強的‘綠霸春四號’根系SOD、POD活性均高于抗低氧能力較弱的‘中農(nóng)八號’，2個品種根系CAT活性無顯著差異。2.4ebr對不同菌株根組織抗氧化酶活性的影響從圖5可以看出，對照區(qū)植株根系內(nèi)LDH、ADH及PDC活性在整個試驗期間保持相對穩(wěn)定；通氣條件下，EBR提高了ADH活性，但作用不明顯；低氧脅迫下，隨處理時間的延長，2個品種幼苗根組織LDH活性均呈上升的變化趨勢，顯著高于對照，‘綠霸春四號’增加緩慢，維持在一個相對穩(wěn)定的水平，抗低氧能力較弱的‘中農(nóng)八號’迅速增加，幅度大于抗低氧能力較強的‘綠霸春四號’。EBR處理2個品種根組織LDH活性均明顯下降。EBR處理2個品種ADH活性均顯著高于單純低氧脅迫處理和對照，約在處理4d時達(dá)到峰值，相同條件下，‘綠霸春四號’根組織ADH活性高于‘中農(nóng)八號’。低氧脅迫下，‘綠霸春四號’根組織ADH活性約在處理8d時仍然顯著高于對照，而‘中農(nóng)八號’根組織已接近對照水平。同時可以看出，低氧脅迫下，隨處理時間的延長，2個品種幼苗根系PDC活性均呈先上升后下降的變化趨勢，且顯著高于對照，‘綠霸春四號’約在處理4d，‘中農(nóng)八號’約在處理2d時達(dá)到峰值，外源EBR降低了‘中農(nóng)八號’根系PDC活性，對‘綠霸春四號’根系PDC活性無明顯影響。3抗低氧脅迫對黃瓜幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響正常環(huán)境條件下，植物體內(nèi)ROS代謝處于動態(tài)平衡之中，低氧脅迫下，植物線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)艿阶璧K，活性氧含量增加，引起膜脂過氧化，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，植株耐低氧性降低(Ushimaru等2001)。生物系統(tǒng)中ROS的產(chǎn)生途徑包括非酶式和酶式反應(yīng)2種。[O2]>10-4mol/L時，[O2]完全飽和了末端氧化酶，酶式O2還原速率達(dá)到最大，脅迫條件下主要為非酶式單電子還原導(dǎo)致O2-·?產(chǎn)生，ROS積累；5×10-7mol/L<[O2]<10-4mol/L時，[O2]基本可以飽和末端氧化酶，但反應(yīng)速率低，非酶式反應(yīng)產(chǎn)生的O2-·?積累少，但是由于O2濃度的降低，呼吸鏈的電子傳遞受阻，電子傳遞過程中會發(fā)生電子泄露，ROS仍然有一定的積累；[O2]<5×10-7mol/L，[O2]不能飽和末端氧化酶，呼吸速率受限，無ROS積累(Skulachev1997;Blokhina等2003)。無氧條件下，小麥根系H2O2含量降低；低氧條件下，小麥根系H2O2含量增加(Biemelt等2000;Blokhina等2001)。本實驗結(jié)果表明，低氧脅迫下黃瓜幼苗根系O2-·?、H2O2和MDA含量(圖3)均高于對照，本實驗低氧脅迫處理營養(yǎng)液溶氧濃度為0.9～1.1mg/L(2.813×10-5～3.125×10-5mol/L)，ROS的產(chǎn)生主要來源于線粒體電子傳遞過程中的電子泄露，且低氧脅迫下細(xì)胞內(nèi)能荷降低、還原力提高、細(xì)胞質(zhì)酸化、有害的Fe2+和Cu2+等低價陽離子過剩等因素都促進了ROS的積累，與高洪波和郭世榮(2004)在網(wǎng)紋甜瓜上的研究結(jié)果相一致。油菜素類固醇(brassinosteroid)已被確定為一種對植物的生長和發(fā)育有重要影響的新激素，BR是迄今為止發(fā)現(xiàn)的生理活性最強的一種天然油菜素甾醇類化合物。研究表明外源施用高油菜素內(nèi)酯BR-120在一定程度上提高了水稻幼苗活性氧清除系統(tǒng)的能力，增強了抗冷性，EBR預(yù)處理顯著降低了鹽脅迫下水稻植株MDA含量(陳善娜等1997;?zdemir等2004)。Ershova和Khripach(1996)研究表明，低氧條件下，梨植株膜脂過氧化衍生物共軛二烯(烴)的含量，EBR處理比單純低氧脅迫處理降低13%，MDA含量降低38%。本研究結(jié)果也表明EBR處理顯著降低了黃瓜幼苗根系MDA、H2O2和O2-·?含量。由此說明，低氧脅迫會造成黃瓜植株體內(nèi)ROS過剩，植物細(xì)胞受到破壞，適宜濃度的EBR處理可以降低植株體內(nèi)ROS含量，緩解低氧脅迫對植株的傷害。低氧脅迫造成的活性氧濃度的提高刺激了植物體內(nèi)SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性增加，植物體內(nèi)還具有抗氧化劑非酶系統(tǒng)，以維持正常的氧化代謝平衡，這是植物對低氧脅迫的一種適應(yīng)機制，較高的保護酶活性與較低的ROS含量是低氧耐性產(chǎn)生的內(nèi)在原因(汪天等2006;高洪波和郭世榮2004)。黃瓜是較耐低氧的植物(Guo和Tachibana1997)，因此在低氧脅迫下，黃瓜體內(nèi)必然要發(fā)生一系列生理生化變化以適應(yīng)短時間的低氧脅迫。本實驗結(jié)果表明，低氧脅迫下，黃瓜幼苗根系中SOD、POD和CAT活性(圖4)比對照有顯著提高，且抗低氧性較強的‘綠霸春四號’比抗低氧能力較弱的‘中農(nóng)八號’抗氧化酶活性要高，表明黃瓜幼苗可通過提高自身抗氧化酶活性來適應(yīng)低氧脅迫。BR與抗氧化系統(tǒng)之間的關(guān)系也有報道，但存在較多疑點；Li和vanStaden(1998)研究表明，BR處理的抗旱性較強的玉米品種在水分脅迫下可保持較高的SOD、POD、CAT活性從而提高植株耐性；但是Cao等(2005)則觀察到，擬南芥油菜素內(nèi)酯缺失體(det2)反而也具有較高SOD和CAT活性，從而比野生型更加耐由百草枯(paraquat)引起的氧化脅迫。本實驗研究結(jié)果表明，正常通氣條件下，EBR處理降低了SOD活性，提高了POD活性，但差異未達(dá)到顯著水平；在低氧脅迫下，外源EBR處理顯著提高了2個品種植株根系SOD和POD活性；在相同條件下，抗低氧性較強的‘綠霸春四號’品種根組織抗氧化酶活性高于抗低氧性較弱的‘中農(nóng)八號’，說明在低氧逆境下，EBR處理可以通過提高植株體內(nèi)保護酶活性而增強植株的抗低氧能力；EBR對抗氧化酶活性的影響在脅迫條件下比正常生長條件下更明顯，與?zdemir等(2004)的研究結(jié)果相一致。低氧條件下，三羧酸循環(huán)和電子傳遞流受阻，細(xì)胞能荷水平顯著降低，根系功能減弱，植物生長發(fā)育遲緩；為減輕低氧脅迫的傷害，植物啟動無氧呼吸代謝(Sachs等1996)，將NADH氧化成NAD+，產(chǎn)生ATP(Perata和Alpi1993)。本實驗結(jié)果表明，低氧脅迫下幼苗根系生長受抑制(圖1、2)，LDH、ADH和PDC活性(圖5)增強，這與前人在其他作物上的研究結(jié)果(Kato-Noguchi2003;Ismond等2003)相一致。低氧脅迫下，抗低氧能力較強的‘綠霸春四號’幼苗根系中ADH活性高于抗低氧能力較弱的‘中農(nóng)八號’，而‘中農(nóng)八號’幼苗根系中LDH活性高于‘綠霸春四號’。由于乳酸發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸可使細(xì)胞質(zhì)酸化，而乙醇發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇為中性分子，并可擴散到外部環(huán)境中，對植物傷害較小(Buchanan等2004)，因此，低氧脅迫下，‘綠霸春四號’根系中較高的ADH活性和較低的LDH活性可能是其抗低氧能力高于‘中農(nóng)八號’的一個重要原因。植株小G蛋白是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要分子開關(guān)，ROP(RHO-relatedGTPaseofplants)參與調(diào)節(jié)激素功能及厭氧代謝等生理過程(Yang2002)。擬南芥轉(zhuǎn)基因植株35S:CA-rop2(CA-rop，組成型活化Rop突變體)的表現(xiàn)型類似BR超表達(dá)植株，在正常通氣條件下，ADH活性顯著提高，而35S:DN-rop2(DN-rop，顯性失活Rop突變體)植株表現(xiàn)型