腦腫瘤中組織型谷氨酰胺氧化酶表達的研究

腦腫瘤中組織型谷氨酰胺氧化酶表達的研究

廣泛分布于組織中的氨基丙烯酸酶（ttg）。這是一種多功能酶。它不僅可以激活各種蛋白質(zhì)，形成聯(lián)合分子，還可以穩(wěn)定細胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)腫瘤生長、細胞分化、細胞死亡和細胞聚集。我們研究采用SP免疫組織化學方法,檢測140例腦腫瘤中tTG蛋白表達,結(jié)合臨床資料分析其與腫瘤組織來源和病理分級的差異性,探討腦腫瘤中tTG蛋白在腫瘤類型和腫瘤惡性程度中所發(fā)揮的作用。材料和方法1.腦腫瘤he染色及病理檢查依據(jù)62例星形細胞瘤、18例少突膠質(zhì)細胞瘤、30例良性腦膜瘤、30例垂體腺瘤標本取自1996年1月～2000年1月我院病理科存檔標本。10例正常腦組織,由內(nèi)減壓術(shù)中取得。全部腦腫瘤標本均進行HE染色,常規(guī)病理檢查,并按照1993年WHO腦腫瘤分類標準進行分級。其中,內(nèi)皮型腦膜瘤12例,成纖維型腦膜瘤9例,沙粒型腦膜瘤2例,混合型腦膜瘤7例。泌乳素細胞腺瘤(PRL腺瘤)15例;生長激素細胞腺瘤(GH腺瘤)15例。星形細胞瘤:Ⅰ級14例;Ⅱ級8例;Ⅲ級12例;Ⅳ級28例。少突膠質(zhì)細胞瘤:Ⅱ級10例;Ⅲ級8例。男性97例,女性53例,年齡8～75歲,平均(42.2±14.3)歲。2.抗水平免疫組織化學(1)鼠抗人tTG單克隆抗體(克隆號:CUB7402):濃縮型,購自美國Maxim公司(稀釋度1∶50);(2)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶(SP法)免疫組織化學染色超敏試劑盒:購自美國Maxim公司;(3)胰蛋白酶試劑盒:購自福州邁新公司;(4)DAB顯色試劑盒:購自美國Maxim公司。3.免疫組織化學染色石蠟標本做連續(xù)4μm厚度切片,HE染色。采用免疫組織化學染色SP方法檢測CD34和tTG,操作按說明書進行。用PBS替代第一抗體作陰性對照。4.染色強度及細胞系數(shù)的計算與兩位病理科醫(yī)師一起觀察每張切片10個具有代表性的高倍視野,tTG蛋白陽性判斷標準:陽性染色者在細胞質(zhì)有棕黃色顆粒沉著。根據(jù)腫瘤細胞質(zhì)的染色程度以及染色細胞百分率計算免疫反應(yīng)評分(immunoreactivescore,IRS)。按照Macpherson等評分公式:IRS=(Pi×i)/4,i為染色強度;Pi為標本的陽性細胞百分率。在觀察標本10個有代表性的視野后,分析染色強度,并在高倍鏡下計數(shù)1000個細胞的陽性細胞數(shù),計算陽性細胞百分率,著色細胞占計數(shù)細胞百分率0～9%為0分,10%～39%為1分,40%～69%為2分,70%～89%為3分,90%～100%為4分;染色強度(i)可分為基本不著色者為0分,著色淡者為1分,著色適中者為2分,明顯著色者為3分,強著色者為4分;分別對每個標本計算IRS得分。5.統(tǒng)計評估采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計,選用One-WayANOVA檢驗進行統(tǒng)計學處理。血管內(nèi)皮細胞外基質(zhì)中ttg蛋白表達多種腦腫瘤tTG蛋白表達特點:腦腫瘤組織中tTG表達呈異質(zhì)性,主要定位于血管內(nèi)皮細胞、部分血管基底膜和部分腫瘤細胞胞質(zhì);細胞外基質(zhì)中有時可見少量表達,但正常腦組織中僅有血管內(nèi)皮細胞有tTG蛋白表達(表1)。此外,值得注意的是在膠質(zhì)母細胞瘤壞死區(qū)周圍的腫瘤細胞tTG蛋白呈強陽性表達。1.不同類型血管內(nèi)皮細胞dtg蛋白表達水平比較全部腦腫瘤和正常腦組織的小動/靜脈和微血管內(nèi)皮細胞均有tTG蛋白陽性表達(圖1～5),部分血管基底膜可見表達。不同類型腦腫瘤血管內(nèi)皮細胞tTG蛋白表達的強度差異有極顯著性意義(P=0.000);其中,不同類型的良性腦膜瘤、垂體腺瘤與正常腦組織之間tTG蛋白表達差異無顯著性(P=0.14),而良性腦膜瘤和垂體腺瘤與星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤之間差異有極顯著性意義(P=0.000);高分級星形細胞瘤(Ⅲ～Ⅳ級)血管內(nèi)皮細胞呈強陽性表達,與低分級(Ⅰ～Ⅱ級)之間比較差異有極顯著性意義(P=0.000,表2)。在正常腦組織的細胞外基質(zhì)中,tTG蛋白表達陰性;在部分腦腫瘤中,血管周圍的細胞外基質(zhì)有tTG蛋白表達,并伴之有部分血管基底膜破裂。2.不同類型腦腫瘤腫瘤細胞ttg蛋白表達變化光鏡下觀察可見tTG表達于星形細胞瘤、少突細胞膠質(zhì)瘤、腦膜瘤和垂體腺瘤部分瘤細胞胞質(zhì),尤其在膠質(zhì)母細胞瘤壞死區(qū)周圍的腫瘤細胞呈強陽性表達(圖5)。不同類型腦腫瘤腫瘤細胞tTG蛋白表達差異有顯著性意義(P=0.037);其中,良性腦膜瘤和垂體腺瘤與星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤之間差異有顯著性意義(P=0.021),但與正常腦組織之間差異無顯著性意義(P=0.154);在相同病理分級的星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤之間比較差異無顯著性意義(P=0.12),而不同病理分級膠質(zhì)瘤之間比較差異有極顯著性意義(P=0.002,表2)。3.不同腦腫瘤中ttg蛋白表達變化由表2可見,腫瘤細胞內(nèi)tTG蛋白表達與患者的性別、年齡差異無顯著性意義(P>0.05)。10例正常腦組織中膠質(zhì)細胞tTG蛋白表達均為陰性,而在多種腦腫瘤中,部分腫瘤細胞中可見tTG蛋白呈陽性表達;隨著膠質(zhì)瘤(星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤)惡性程度的增加,tTG蛋白在腫瘤細胞中的表達強度明顯增高(P<0.001);與低分級(Ⅰ～Ⅱ級)相比,高分級星形細胞瘤(Ⅲ～Ⅳ級)tTG蛋白表達顯著增強。正常腦組織與膠質(zhì)瘤相比,tTG蛋白表達差異有極顯著性意義(P<0.0001)。此外,有1病例病理診斷為星形細胞瘤左額葉Ⅲ級及左顳葉Ⅳ級,其Ⅳ級瘤細胞tTG蛋白表達明顯強于Ⅲ級瘤細胞。4.低倍鏡下效果在膠質(zhì)母細胞瘤中,發(fā)現(xiàn)在壞死和凋亡組織周圍的腫瘤細胞tTG蛋白表達呈強陽性。在腫瘤壞死區(qū)邊緣形成一條‘隔離帶’,在低倍鏡下,可以直接區(qū)分壞死組織和非壞死組織(圖5),稱之為“假欄柵細胞”。壞死組織周圍的“假欄柵細胞”中tTG蛋白表達最為強烈,而壞死組織內(nèi)基本沒有tTG蛋白表達。在光鏡下觀察,可以看到凋亡小體呈tTG蛋白陽性染色,但是tTG蛋白陽性腫瘤細胞自身沒有表現(xiàn)出明顯的凋亡形態(tài)學特征。連蛋白的表達谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG)是鈣依賴性激酶家族成員之一,目前發(fā)現(xiàn)有5種亞型,其中tTG蛋白分布最為廣泛,在血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等多種組織細胞中有表達。tTG蛋白是一種多功能酶,可以催化多種蛋白質(zhì)形成交聯(lián)分子。研究發(fā)現(xiàn),在細胞內(nèi)tTG蛋白介導形成的蛋白交聯(lián)大分子可以成為多種病理狀態(tài)的標記物,例如,老年性癡呆癥組織中的老年斑和帕金森病組織中的Lewy小體均由tTG蛋白催化形成。目前已發(fā)現(xiàn)肝細胞瘤、橫紋肌肉瘤和乳腺癌tTG蛋白表達量與酶活性均有不同程度的增加。而且在神經(jīng)系統(tǒng)中,tTG蛋白與神經(jīng)元發(fā)育、軸突生長和神經(jīng)遞質(zhì)釋放有密切關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)多種腦腫瘤的血管內(nèi)皮細胞和瘤細胞內(nèi)的tTG蛋白表達與患者的性別、年齡差異無顯著性意義。其中,正常腦組織和多種腦腫瘤的血管內(nèi)皮細胞tTG蛋白呈陽性表達,支持Haroon等認為血管內(nèi)皮細胞可以合成和分泌tTG蛋白的研究結(jié)果。Chen等發(fā)現(xiàn),在血管內(nèi)皮細胞中tTG表達的增加可以促進細胞黏附和運動,增加纖維黏連蛋白的聚合作用。膠質(zhì)母細胞瘤血管內(nèi)皮細胞中tTG蛋白表達增加,低分級星形細胞瘤中血管內(nèi)皮細胞表達弱或不表達,提示tTG表達有助于血管形成和生長。此結(jié)果與Hilton等的研究結(jié)果基本一致。膠質(zhì)母細胞瘤血管內(nèi)皮細胞過度表達的tTG可能通過纖維蛋白原交聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮一定作用,并通過促進血栓形成參與膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生多發(fā)性壞死的過程。在本研究中還發(fā)現(xiàn)部分Ⅳ級星形細胞瘤血管周圍的細胞外基質(zhì)有tTG蛋白表達,伴隨部分血管基底膜發(fā)生破裂,提示細胞外基質(zhì)中的tTG蛋白可能是血管內(nèi)皮細胞合成后分泌或破裂釋放的。此外,隨著膠質(zhì)瘤(星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤)分化程度的降低,tTG蛋白在腫瘤細胞上的表達強度明顯增加,且高分級膠質(zhì)瘤(Ⅲ～Ⅳ級)tTG蛋白表達陽性率顯著高于低分級(Ⅰ～Ⅱ級),這與Iwaki等提出的在膠質(zhì)瘤中tTG蛋白表達可以促進腫瘤惡性演變的觀點相一致。Tunici等在鼠腦膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn),隨著腫瘤細胞的增殖,tTG蛋白表達量進行性增多;tTG蛋白活性在膠質(zhì)瘤中發(fā)生重新分布,晶體樣tTG較正常腦組織減少50%,與之相反的是具有催化蛋白質(zhì)交聯(lián)活性的顆粒樣tTG增加了380%。另有研究表明,作為具有GTP酶活性的GTP結(jié)合蛋白,tTG可以激活蛋白激酶C,進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期的進展,促進腫瘤增殖和惡性進展。在本研究中,有1病例為巨大左額顳葉膠質(zhì)瘤,病理診斷為星形細胞瘤左額葉Ⅲ級,左顳葉Ⅳ級,其顳葉Ⅳ級瘤細胞tTG蛋白表達明顯強于額葉Ⅲ級瘤細胞,表明同1病例的不同亞細胞群腫瘤細胞tTG蛋白表達也存在差異性,推測tTG蛋白可能促進星形細胞瘤的惡性進展。經(jīng)體外研究發(fā)現(xiàn),tTG活性增加有助于腫瘤細胞與纖連蛋白穩(wěn)定結(jié)合;進一步研究又發(fā)現(xiàn),纖連蛋白可以與tTG結(jié)合,對抗基質(zhì)金屬蛋白酶對tTG的分解作用,保護細胞,促進細胞黏附和運動。在膠質(zhì)母細胞瘤中,發(fā)現(xiàn)在壞死和凋亡組織周圍的腫瘤細胞tTG蛋白表達呈強陽性,假欄柵細胞中表達最為強烈,壞死組織內(nèi)基本沒有tTG蛋白表達的實驗結(jié)果,證實了Hilton等和Iwaki等研究結(jié)果,表明高度惡性腫瘤細胞可通過表達tTG蛋白進行自我保護,使腫瘤內(nèi)的細胞壞死和凋亡局限化,從而對抗機體細胞免疫和體液免疫反應(yīng)對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)。并且,tTG蛋白表達有可能具有穩(wěn)定細胞,保持細胞完整性,阻止或延緩細胞釋放溶酶體酶等細胞毒性物質(zhì)的功能,避免繼發(fā)性機體炎癥反應(yīng)?？傊?tTG蛋白屬于一種保護腫瘤細胞的蛋白,可以‘組裝’和‘重建’腫瘤細胞外基質(zhì)、對抗凋亡和壞死細胞對其他腫瘤細胞的破壞。tT