氧化還原態(tài)失衡與動脈粥樣硬化的關(guān)系

氧化還原態(tài)失衡與動脈粥樣硬化的關(guān)系

氧氣損傷與動脈硬化的發(fā)展關(guān)系得到了廣泛認(rèn)可，但還原性維生素對動脈硬化的預(yù)防效果并不理想。其中部分原因可能與動脈粥樣硬化患者的氧化還原態(tài)(redoxstatus)不同有關(guān)。正常人有一個相對穩(wěn)定的氧化還原平衡態(tài)。偏離該平衡態(tài),無論向氧化方向偏移或向還原方向偏移都可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。動脈粥樣硬化患者的氧化還原態(tài)如何改變尚少見報道,為此,本研究對167例心血管病患者血漿氧化還原態(tài)進行監(jiān)測,并同期進行頸部血管超聲檢查,探討血漿氧化還原態(tài)變化與其頸動脈內(nèi)膜增厚及粥樣斑塊形成的關(guān)系,以期為動脈粥樣硬化的認(rèn)識及防治提供新的思路。數(shù)據(jù)和方法一、患者性別、年齡及分組所有患者為2004年2月至2005年9月在河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科的住院患者,共167例,男96例,女71例,年齡41~86(74.6±17.9)歲。排除嚴(yán)重肝、腎疾病、內(nèi)分泌代謝疾病、結(jié)締組織疾病和腫瘤。患者行頸部血管超聲檢查,按內(nèi)膜中層厚度或斑塊形成分為三組:斑塊形成組(A組)79例;內(nèi)膜中層增厚組(B組)52例;內(nèi)膜中層正常組(C組)36例。二、學(xué)習(xí)方法1.頸動脈內(nèi)動脈檢查采用SONO5500型彩色超聲血流儀,行兩側(cè)頸動脈檢查,固定專人測定,探頭頻率為7.5MHz?；颊哐雠P位,先從鎖骨的內(nèi)側(cè)端橫向掃查頸總動脈,然后將探頭沿其行走方向向頭側(cè)移位,跨過分叉部,分別檢測患者雙側(cè)頸總動脈、頸動脈分叉部、頸內(nèi)動脈起始處、頸外動脈。檢查內(nèi)容包括:頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)及有無斑塊形成。內(nèi)膜中層厚度<1.0mm定義為內(nèi)膜中層厚度正常,內(nèi)膜中層厚度1.0mm~1.3mm為內(nèi)膜中層增厚,以內(nèi)膜局限性突出管腔、內(nèi)膜厚度≥1.3mm為斑塊形成指標(biāo)。以任何一處最大IMT作為判定標(biāo)準(zhǔn)。2.還原型還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的制備取研究對象清晨空腹靜脈血3ml,放入預(yù)冷肝素抗凝管中,試管放在冰水混合物中保存,1h內(nèi)低溫(4℃)5000r/min,離心3min,取500μl血漿超低溫(-30℃)保存在EP管中,備測還原型輔酶Ⅱ(NADPH)和氧化型輔酶Ⅱ(NADP+)。另取750μl血漿加入10%偏磷酸750μl,低溫(4℃)5000r/min,離心15min,取上清液500μl,超低溫(-30℃)保存在EP管中,備測還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。其余血漿用以測定氧化應(yīng)激產(chǎn)物:氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)和丙二醛(MDA)。3.mda和mda的測定ox-LDL用ELISA法測定(試劑盒由上海榮盛生物有限公司提供),MDA用硫代巴比妥法檢測(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供),所有測定步驟均按說明書嚴(yán)格操作。4.gsh的衍生化(1)測定的基本過程:利用熒光分光光度計對GSH及GSSG標(biāo)準(zhǔn)品進行全波長掃描,確定激發(fā)波=334.4nm,發(fā)射波=424nm以及5nm的譜帶寬度,以pH8.3的磷酸鹽緩沖液作為緩沖液,用100μl10mmol/L鄰苯二甲醛甲醇溶液對GSH進行衍生化30min后測熒光值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為自變量,熒光值為應(yīng)變量,求直線方程,YGSH=6.9+8.6X,YGSSG=6.2+17.2X,并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)此測定三組研究對象血漿GSH及GSSG。(2)GSH/GSSG氧化還原電位的計算:按Nernst方程:Eh=E0+RT/2Fln[(GSSG)/(GSH)2]。其中,R為氣體常數(shù),T為溫度,F為法拉第常數(shù)。E0為GSH-GSSG的標(biāo)準(zhǔn)電位值,以血液pH值=7.4時,標(biāo)準(zhǔn)E0為-264mV。根據(jù)此公式計算GSH-GSSG的氧化還原電位值。5.nadph的測定(1)測定的基本原理:經(jīng)酸或堿處理后,血漿中只剩下一種形式的輔酶Ⅱ(NADPH被酸破壞,NADP+被堿破壞)進入循環(huán)反應(yīng),NADPH可在N-甲基吩嗪甲基硫酸鹽中介下,使噻唑藍(lán)還原為甲肷,同時生成的NADP+再次經(jīng)6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用生成NADPH(NADP+的循環(huán)測定從此步反應(yīng)開始),再使噻唑藍(lán)還原為甲肷,后者生成率與輔酶Ⅱ的含量成比例。因為甲肷在570nm處有最高吸收峰,因此可用分光光度法測定某一時間點的吸光光度值,根據(jù)輔酶Ⅱ的標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量血漿中NADPH含量和NADP+含量。(2)NADP+和NADPH氧化還原電位的計算:按Nernst方程:Eh=Eo+RT/2Fln[(NADP+)/(NADPH)]。其中,R為氣體常數(shù),T為溫度,F為法拉第常數(shù)。E0為NADP+/NADPH的標(biāo)準(zhǔn)電位值,以血液pH值=7.4時,標(biāo)準(zhǔn)E0為-342mV。根據(jù)此公式計算NADP+/NADPH的氧化還原電位值。三、統(tǒng)計分析方法全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件包進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析,兩個指標(biāo)的相關(guān)性采用相關(guān)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果一、gsh/gssg氧化還原電位隨動脈內(nèi)膜增厚、斑塊形成,血漿GSH含量逐漸減少,血漿GSSG含量逐漸增多,GSH/GSSG比值降低,GSH/GSSG氧化還原電位升高向氧化方向偏移(表1)。二、血漿中的酶氧化還原隨動脈內(nèi)膜增厚、斑塊形成,NADPH/NADP+的氧化還原態(tài)顯示出與谷胱甘肽相似的變化,但不如谷胱甘肽氧化還原態(tài)的變化明顯(表2)。三、群體中的革蘭氏反應(yīng)產(chǎn)物水平氧化應(yīng)激產(chǎn)物ox-LDL和MDA,斑塊形成組高于內(nèi)膜中層增厚組,內(nèi)膜中層增厚組高于內(nèi)膜中層正常組,比較詳見表3。四、谷胱甘肽氧化還原電位上述結(jié)果顯示,將患者按頸動脈內(nèi)膜厚度分組時,隨內(nèi)膜增厚、斑塊形成,各氧化還原態(tài)指標(biāo)都產(chǎn)生相應(yīng)的氧化偏移。由于谷胱甘肽氧化還原電位是顯示血漿氧化還原電位的較直觀指標(biāo),該電位越高(負(fù)值越小),表示氧化能力越強。為此,我們將谷胱甘肽氧化還原電位變化與氧化應(yīng)激的損傷產(chǎn)物ox-LDL行相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)它們之間具有緊密的內(nèi)在聯(lián)系。NADPH/NADP+的氧化還原電位與氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)物ox-LDL的關(guān)系不如谷胱甘肽明顯,故未納入相關(guān)分析。1.由于葡萄糖氧化還原態(tài)位移的關(guān)系，ox-ldl產(chǎn)生的絡(luò)合物含量谷胱甘肽氧化還原電位向氧化方向偏移度與ox-LDL生成量呈顯著直線正相關(guān),γ=0.817,P<0.01(圖1)。2.氧化還原電位從動脈內(nèi)膜正常到動脈內(nèi)膜增厚,GSH/GSSG氧化還原電位逐漸升高,向氧化方向偏移;從動脈內(nèi)膜增厚到動脈內(nèi)膜粥樣斑塊形成,GSH/GSSG氧化還原電位進一步升高(圖2)。gsh/gssg氧化還原態(tài)的偏離子研究本研究顯示,將患者按超聲心動圖監(jiān)測的頸動脈內(nèi)膜厚度分組時,隨內(nèi)膜增厚(提示動脈粥樣硬化的發(fā)展),其氧化還原態(tài)指標(biāo)、特別是還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)氧化還原電位逐漸升高,顯示出進行性的氧化偏移,其氧化還原平衡態(tài)向氧化方向偏移度與ox-LDL的生成呈顯著正相關(guān)。GSH/GSSG被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)主要的氧化還原緩沖對,GSH可清除活性氧,維持生物大分子的巰基活性中心,細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶等重要的抗氧化損傷、解毒酶類都需要GSH提供活性巰基。另一方面,蛋白質(zhì)分子中大量的二硫鍵結(jié)構(gòu)亦與蛋白質(zhì)的功能密不可分,這亦需要一定的GSH/GSSG氧化態(tài)維系。因此,機體內(nèi)必有一個相當(dāng)恒定的GSH/GSSG氧化-還原平衡態(tài)。GSH/GSSG向氧化方向偏移時可產(chǎn)生類似過氧化氫增多時產(chǎn)生的氧化損傷效應(yīng)。ox-LDL和丙二醛是氧化應(yīng)激損傷的產(chǎn)物,特別是ox-LDL,被認(rèn)為與動脈粥樣硬化的發(fā)病有密切的關(guān)系。因此,本研究選擇上述指標(biāo)以觀察氧化還原態(tài)偏移及其對氧化應(yīng)激損傷的影響。還原性維生素(VitC,VitE)治療動脈粥樣硬化的氧化應(yīng)激損傷,是一條合理思路,已被部分醫(yī)務(wù)人員用于臨床。但一些大樣本、多中心的研究結(jié)果顯示,還原性維生素對動脈粥樣硬化的預(yù)防、治療效果并不理想。我們認(rèn)為,由于個體內(nèi)在的氧化還原態(tài)偏移方向和程度的差異,均使用“規(guī)定”劑量的還原性維生素,并不適于矯正所有患者的氧化還原態(tài)偏移。而且,由于機體基礎(chǔ)氧化還原態(tài)的差異,還原性維生素并不總能提供抗氧化保護。氧化-還原反應(yīng)是根據(jù)反應(yīng)體系中氧化還原電勢來決定電子流向的,如維生素C是一個典型的抗氧化劑,但一定條件下卻可以生成抗壞血酸自由基,成為一個氧化增強劑。還原性維生素不一定能矯正細(xì)胞內(nèi)最重要的GSH/GSSG氧化還原對的偏移。因此,了解不同患者體內(nèi)氧化還原態(tài)的偏移方向和程度,應(yīng)是制定抗氧化應(yīng)激方案的基礎(chǔ)。而本研究的結(jié)果顯示:動脈粥樣硬化患者的GSH/GSS