窖池發(fā)酵過程中酒醅內(nèi)酵母菌的分離與分類統(tǒng)計

./論文論文題目：作者：單位：20XX7月摘要:白酒的生產(chǎn)以泥窖窖池為基礎(chǔ),窖池中的多種微生物,特別是棲息于酒醋中的微生物左右著酒的產(chǎn)量和品質(zhì)。酵母菌同時起著發(fā)酵酒精和產(chǎn)生香味物質(zhì)的作用,是窖池發(fā)酵三大菌群之一,它們在發(fā)酵過程中的消長情況值得關(guān)注。本研究分別選取本廠南車間的一口窖池以及北車間的兩口窖池作為分析對象。分別從原料入窖到出窖蒸餾進行全程跟蹤采樣,采樣方法如下：按發(fā)酵0天<入窖>、7天、14天、2l天、28天、49天、70天<出窖>的時間點取樣7次；每次共計6個空間區(qū)域,即窖池酒醅按縱向分上中下三層,每一層分中心區(qū)域和周邊區(qū)域,同區(qū)域取3點樣混合均勻；7次取樣共獲36個樣品<入窖和出窖樣只有上中下3個樣品>。首先,采用傳統(tǒng)的分離技術(shù)對每份樣品進行平板計數(shù),以便分析在各個窖池發(fā)酵過程中不同取樣位置酵母菌數(shù)量的變化情況；然后采用常規(guī)的鑒定方法對分離到的菌株進行鑒定,以探討發(fā)酵過程中存在的優(yōu)勢菌群；最后,采用18SrDNA序列分析方法,驗證常規(guī)鑒定結(jié)果的準確性,并對各菌屬進行系統(tǒng)發(fā)育分析。關(guān)鍵詞：窖池發(fā)酵酵母數(shù)量消長優(yōu)勢菌群系統(tǒng)發(fā)育濃香型白酒窖池發(fā)酵過程中酵母類微生物的分析緒長期以來,微生物的平板分離計數(shù)法<即活菌計數(shù)法,CFU法>一直是我國科研工作者研究窖池微生物區(qū)系的重要手段。本法將樣品用無菌生理鹽水進行系列稀釋,取合適的稀釋度<一般三個稀釋度>,以涂布法接種于平板,或以混碟法進行操作,經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)之后,直接統(tǒng)計平板的菌落。該方法測定的是樣品中所含的現(xiàn)時可培養(yǎng)的活的微生物數(shù)量,所以稱之為活菌計數(shù)法。平板分離計數(shù)法中,每個菌落由一個單細胞繁殖而成,為肉眼可見的細胞群體,一般來說在每個平板形成30～300個菌落屬于有效圍,該法所測數(shù)值有可能偏低,因為有可能兩個或以上的單細胞在一起形成一個菌落,也可能培養(yǎng)條件不適。平板分離計數(shù)法僅能對可培養(yǎng)微生物進行統(tǒng)計且存在一定的偏差,雖然有其一定的缺陷性,但它可以得到活的菌落培養(yǎng)物,再通過純化分離可得到純種的微生物培養(yǎng)物,更全面地保留了特定微生物的信息,這是當(dāng)前微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)所不能做到的。材料與方法1實驗材料1.1樣品來源分離培養(yǎng)基選擇用樣品采自南車間一窖池的出窖糟醅。分析樣品選取本廠南車間的一個窖池,以及北車間的兩個窖池分別進行跟蹤采樣,采樣方法如下：按發(fā)酵0天<入窖>、7天、14天、21天、28天、49天、70天<出窖>時間點跟蹤取樣7次；每次共計6個空間區(qū)域,即窖池酒醅按縱向分上中下三層<窖頂以下50-75cm,150-175cm,250-275crn>,按橫向分中心區(qū)域<中心區(qū)75cm以>和周邊區(qū)域<距窖頂各邊5．20cm環(huán)帶>,同區(qū)域取3點樣進行混合平均；7次取樣共獲36個樣品<入窖和出窖樣只有上中下3個樣品>。1.2培養(yǎng)基酵母分離用培養(yǎng)基.1YPD培養(yǎng)基[4]葡萄糖20g蛋白胨20g酵母膏10g瓊脂20g蒸餾水100ml113℃1.2.1.2米米曲汁培養(yǎng)基的制法：1>將干米曲磨碎,一份米曲加四份水。在65℃2>將糖化液用4～6層紗布過濾,濾液如混濁不清,可用及蛋白澄清。方法是將一個雞蛋白加水約20ml,調(diào)勻至泡沫時為止,然后倒在糖化液中攪拌煮沸后在過濾。3>將濾液稀釋到5～6波美度,PH約6.4,加入2%瓊脂。121℃.3麥氏瓊脂培養(yǎng)基[4]葡萄糖1gKCl1.8g酵母浸膏2.5g醋酸鈉8.2g瓊脂20g蒸餾水1000ml113℃酵母鑒定用培養(yǎng)基[6]麥芽汁液體培養(yǎng)基：將麥芽汁調(diào)至lO波林的糖度,pH至5.4；過濾后分裝試管,每管4ml；113℃麥芽汁固體培養(yǎng)基：以10波林麥芽汁,加2%瓊脂,加熱熔解,分裝試管；113℃McClary培養(yǎng)基：葡萄糖0.1%,KCl0.18%,酵母膏0.25%,醋酸鈉O.82%,瓊脂2%,用蒸餾水配：裝試管；113℃Kleyn培養(yǎng)基：KH2P040.012%,K2HP040.02%,醋酸鈉0.5%,葡萄糖0.062%,NaCl0.062%,蛋白胨O.25%,水洗瓊脂2%,生物素2.O微克%,每100ml加混合鹽類lml,蒸餾水配,pH6.9～7.1；裝管；113℃混合鹽溶液：MgSO4·7H20O.4%,NaClO.4%,CuS04·7H200.002%,MnS04·4H200.2%,FeS04·4H200.2%。Gorodkowa培養(yǎng)基：葡萄糖0.1%,蛋白胨l%,NaCl12%,水洗瓊脂2%,蒸餾水配；裝管；113℃馬鈴薯塊培養(yǎng)基：將馬鈴薯去皮,切成長條斜面；裝入試管<在底部預(yù)先墊上一小團濕棉球>；113℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200克,葡萄糖20克,瓊脂20克,自來水1升。將馬鈴薯洗凈,去皮,切成小塊,立即放入水中,以免被氧化。煮沸30分鐘,經(jīng)紗布過濾,濾液加水至1升,加入葡萄糖和瓊脂,溶解后分裝三角瓶或試管,113℃玉米粉瓊脂：稱取12.5克黃玉米粉,加水300ml攪勻,以60℃水浴保溫lh,用紙過濾,濾液加水至300ml,加3.89瓊脂,121℃15min滅菌,趁熱用脫脂棉過濾,裝入試管,每管20ml,糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1>12.5%豆芽汁：黃豆芽125g加水1L,煮沸半小時,過濾后補足水至lL。113℃2>0.6%酵母浸汁：加60g干酵母粉于lL水中,必要時加一些蛋清澄清濾液；121℃滅菌15min,趁熱用雙層濾紙過濾；113同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：<NH4>2S040.5%,KH2P040.1%,MgS04·7H200.05%,酵母膏0.02%,CaCl2·2H200.01%,NaCl0.01%,糖或其他碳源O.5%,用蒸餾水配,培養(yǎng)基過濾后分裝小試管,每管約3ml,113℃同化乙醇基礎(chǔ)培養(yǎng)基：<NH4>2S040.1%,KH2P040.1%,MgS04·7H200.05%,酵母膏0.01%,用蒸餾水配,過濾后每管定量裝5ml,113℃同化氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2%,KH2P040.1%,MgS04·7H200.05%,酵母膏0.02%,水洗瓊脂2%,用蒸餾水配,過濾后裝大試管,每管約20ml,113℃產(chǎn)類淀粉化合物培養(yǎng)基：<NH4>2S040.5%,KH2P040.1%,MgS040.05%,酵母膏O.1%,CaCl2·2H200.01%,NaCl0.01%,葡萄糖3%,用蒸餾水配,分裝于50ml三角瓶中,約5ml,113℃產(chǎn)酯培養(yǎng)基：葡萄糖5%,用10%豆芽汁配制,分裝于50ml三角瓶中,每瓶20ml,113℃無維生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基：<NH4>2S040.5%,KH2P040.1%,MgS04·7H200.05%,CaCl2·2H200.01%,NaCl0.01%,葡萄糖2%,加蒸餾水100ml,分裝試管,每管5ml,113℃石蕊牛奶：取新鮮牛奶,煮沸15min,冷卻后,置冰箱過夜,用虹吸管吸取下層液,除去上層脂肪,即成脫脂牛奶。每lL脫脂牛奶加2.5%石蕊水溶液4ml。分裝試管,113℃2實驗方法2.1菌株分離培養(yǎng)基的選擇菌株的分離參照周德慶等[6],采用稀釋平板菌落計數(shù)法,培養(yǎng)溫度為28℃1>取3支無菌空試管<15×150mm>,依次編號為10-1、10-2、10-3,YPD培養(yǎng)基平板也分別編號為10-1、10-2、10-3,每個稀釋度各3只平板；2>按無菌操作,用5ml移液管分別吸取4.5ml無菌水于編好號的各無菌空試管中；3>稱取2g酒醅樣品,加入到裝在三角瓶中的200ml無菌水中,充分振蕩搖勻：4>用1ml無菌移液管精確吸取0.5ml菌液于標(biāo)為"10-1”試管中,另取一支1ml的無菌移液管,先在"10-1”菌液管中來回吹吸數(shù)次,再精確吸取0.5ml菌液于標(biāo)為"10-2”5>分別精確吸取三個稀釋梯度的菌液0.2ml,對號加在YPD培養(yǎng)基平板上,立即用涂棒迅速將菌液均勻涂開；6>將涂布后的平板倒置于28℃分離效果的評價主要從菌落數(shù)量、形態(tài)類別、分離效果等指標(biāo)進行判斷。選擇分離效果好的作為后續(xù)試驗的培養(yǎng)基。2.2發(fā)酵過程中菌株數(shù)量的分析菌株分離培養(yǎng)及計數(shù)以YPD為酵母分離培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)2～3天,采用稀釋平板菌落分離計數(shù)法進行計數(shù)嘲。具體操作方法參見。整個周期菌株數(shù)量的變化分別對3個窖池,不同取樣時間和不同取樣位置的酵母菌數(shù)進行計量,并進行相互之間的比較。不同窖池中菌株數(shù)量的比較按同一取樣時間,同一取樣位置,對3個窖池的酵母菌數(shù)進行橫向比較。2.3不同窖池優(yōu)勢菌群的比較菌種鑒定菌落經(jīng)純化后,參考中科院微生物所《常見與常用真菌》、紀中《微生物分類學(xué)》、周德慶等《微生物學(xué)實驗手冊》[6、7、8]等相關(guān)的微生物分類鑒定系統(tǒng)的方法,對分離菌株進行以下兩方面的考察：1>形態(tài)特征：細胞形態(tài)學(xué)觀察,固體及液體培養(yǎng)特征,子囊孢子的形成,假菌絲的形成和形態(tài),以及擲孢子的形成和形態(tài)；2>生理特性：糖類發(fā)酵,碳源同化,氮源同化,產(chǎn)類淀粉化合物的測定,產(chǎn)酯測定,牛奶胨化或凝固,脂肪分解,在無維生素培養(yǎng)基中的生長實驗,37℃優(yōu)勢種群的分析根據(jù)菌種鑒定的結(jié)果,對3個窖池中酵母菌優(yōu)勢種群進行比較。結(jié)果與討論1酵母分離用培養(yǎng)基的選擇酵母在YPD培養(yǎng)基、米曲汁培養(yǎng)基、麥氏培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)情況見表1-1。所有的平板采用同一菌懸液稀釋度<10-1>及涂向量<O.2ml>進行培養(yǎng)和計數(shù),實驗中采用的是北車間的出窖酒醅。由實驗結(jié)果可以看出,三種培養(yǎng)基在酵母形態(tài)及類別上幾乎一致,但從酵母的生長菌落數(shù)及分離效果而言,明顯以YPD培養(yǎng)基為好,可見采用YPD培養(yǎng)基町以對濃香型白酒糟醅中的酵母菌達到最好的分離培養(yǎng)效果。由于在對窖池糟醅酵母菌變化的研究中,微生物的分離培養(yǎng)足基礎(chǔ),因而培養(yǎng)基的選擇是關(guān)鍵,能較好地滿足多種類型微生物的生長和繁殖,才能最大限度和比較客觀地反映糟醅中微生物的種類及其數(shù)量,探討其變化規(guī)律。根據(jù)實驗結(jié)果,我們認為對濃香型白酒糟醅中酵母的分離培養(yǎng),以YPD培養(yǎng)基為宜,其配方及配制情況如下：葡萄糖20g,蛋白胨20g,酵母膏l(xiāng)0g,瓊脂20g,蒸餾水1000ml,pH自然,113℃2整個發(fā)酵周期中酵母菌數(shù)的變化2.1南車間窖池南車間窖池在發(fā)酵過程中各發(fā)酵時間點及各空間位置的酵母菌的動態(tài)變化結(jié)果如表2-l。從發(fā)酵時間來看,酵母菌數(shù)量從入窖到發(fā)酵7天總體上來說是一個迅速增加的過程,含最最高時每克酒醅樣中酵母菌數(shù)量為105數(shù)量級。過了7天這個高峰后,隨時間的推移,菌數(shù)基本上是逐漸減少。發(fā)酵三周后,酵母菌數(shù)基本趨于穩(wěn)定,沒有大的變化,且各個取樣點的數(shù)量都處在一個較低的水平上,大都只達到102數(shù)量級。結(jié)合相關(guān)理化的分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵一周,由于霉菌對淀粉質(zhì)原料的糖化作用,還原糖含量達到最大值,因此酵母菌數(shù)量呈一個急劇增加的過程。7天后,酒醅中酒精濃度迅速增加,21天后達到最大值,以后略有下降并逐漸趨于穩(wěn)定。發(fā)酵溫度在14天后達到最高點<34℃從各空間位置來看,酵母菌數(shù)在同一取樣層的中間和邊沿總體上是一致的,最多只有倍數(shù)的差距,沒有達到數(shù)量級的差距。以不同的取樣層相比較,除入窖樣中上層菌數(shù)大大低于中層菌數(shù)而外,在以后的發(fā)酵過程中這兩層的菌數(shù)基本沒有大的差異。而下層樣的菌數(shù)卻遠遠低于上層和中層,大都處于102的數(shù)量級,且在入窖和出窖樣中都沒檢測到?？赡苁怯捎谠诙噍喌装l(fā)酵工藝中,下層多輪不出窖蒸餾,經(jīng)過多輪發(fā)酵的窖底酒醅一直未經(jīng)更換,形成了一個極度厭氧和酸性的環(huán)境,加上一些不利酵母增殖的代產(chǎn)物的積累,因此酵母菌數(shù)量從入窖開始就維持在一個很低的水平。2.2北車間窖池1北車間窖池1在發(fā)酵過程中各發(fā)酵時間點及各空間位置的酵母菌的動態(tài)變化結(jié)果如表2-2所示。從發(fā)酵時間來看,酵母菌數(shù)量從入窖到發(fā)酵7天總體上來說是一個迅速增加的過程,這和南車間有一致性。但是每克酒醅樣中酵母菌數(shù)量大都達到106數(shù)量級,最高到達107,這是遠遠超過南車間的。且在上層樣中從第7天到21天,總菌數(shù)不降反呈緩慢上升的趨勢,在中層樣中也是到了14天以后總菌數(shù)才開始減少。從各空間位置來看,同處一層的中間和邊沿樣的酵母菌數(shù)總體上沒有太大差別,這一點也同南車間是一致的。以不同的取樣層相比較,仍然是入窖樣中上層菌數(shù)大大低于中層菌數(shù),在以后的發(fā)酵過程中,上層菌數(shù)卻稍多于中層。而下層樣的菌數(shù)卻遠遠低于上層和中層,大部處于102的數(shù)量級,有的樣品中甚至沒有檢測到。其原因應(yīng)該與南車間是一致的。2.3北車間窖池2北車間窖池2在發(fā)酵過程中各發(fā)酵時間點及各空間位置的酵母菌的動態(tài)變化結(jié)果如表2-3所示。從發(fā)酵時間來看,從入窖到出窖酵母菌數(shù)量是一個逐漸減少的過程,這和南車間、北車間窖池1呈現(xiàn)的趨勢都不相同。但是每克酒醅樣中酵母菌數(shù)量較大,與北車間窖池1有相似之處,最高也到達107數(shù)量級,同樣遠遠超過南車間。從各空間位置來看,同處一層的中間和邊沿樣的酵母菌數(shù)總體上仍然沒有太大差別,這與前兩個窖池是一致的。以不同的取樣層相比較,大體呈現(xiàn)上層樣總菌數(shù)多于中層,中層又多于下層的趨勢。但是在入窖樣中,中層菌數(shù)卻低于下層菌數(shù),7天以后下層還是能難檢測到有酵母的存在。這也許是本窖池采用了與前兩個窖池不同的非雙輪底發(fā)酵工藝,同時在拌料時人為加大了酵母接種量,所以才出現(xiàn)下層能檢測到大量酵母存在以及整個入窖樣中菌數(shù)基本都比以后多的現(xiàn)象。3發(fā)酵過程中優(yōu)勢酵母菌群的變化3.1南車間窖池中的優(yōu)勢菌群在南車間窖池中,先后檢測到了漢遜酵母<Hansenula>、酒香酵母<Brettanomyces>、固囊酵母<Citeromyces>、卵孢酵母<Oosporidium>、德克酵母<Dekkera>和管囊酵母<Pachysolen>。它們在整個發(fā)酵過程的時間上,以及整個窖池空間中的分布情況分述如下。漢遜酵母屬〔Hansenula從表中可以看出,漢遜酵母在入窖樣的上層和中層都有所檢出,且主要集中在入窖和發(fā)酵14天的樣品中。下層中在任何發(fā)酵時間點都沒有檢測到它的存在。結(jié)果見表3-l所示。酒香酵母屬<Brettanomyces>在入窖的上層和中層中榆測到了酒香酵母,而且中層的數(shù)最多于上層樣,這與整個酵母的情況是一致的。在其他的時間點及位置中沒育檢測到它的存在。結(jié)果見表3-2所示。固囊酵母屬〔Citeromyces>周囊酵母屬在時間和空間上都有較廣泛的存在。我們分別在發(fā)酵7天、21天、28天和49天的樣品中檢測到了同囊酵母,并且數(shù)量較多,特別足第7天,在總菌數(shù)種占了非常高的比例。另外,發(fā)酵后期的下層樣中也有其存在,表明固囊酵母對下層的惡劣環(huán)境有一定的耐受性。結(jié)果見表3-3所示。卵孢酵母屬<Oosporidium>卵孢酵母主要存在于入窖的中層樣中,并占有較大的比例。另外,在發(fā)酵7天的上、中層和發(fā)酵28天的上層中也有一定數(shù)量的存在,下層中也有少量的檢出。結(jié)果見表3-4所示。德克酵母屬<Dekkera>德克酵母在時間和空間上的分布也比較廣泛。入窖中層樣,發(fā)酵7天和發(fā)酵14天的上中層都有較多量的檢出。發(fā)酵后期的上中層以及發(fā)酵前期的下層樣中也能檢測到有少量的存在。結(jié)果見表3-5所示。管囊酵母屬<Pachysolen>管囊酵母主要在入窖和發(fā)酵28天這兩個時間點檢測到,并且分別存在于中層和上層這兩個位置。出窖的上層樣中也有少量存在,在整個發(fā)酵周期的下層中部沒有檢出。結(jié)果見表3-6所示。南車間窖池酵母優(yōu)勢菌群概述從上面的結(jié)果可以看出,雖然在南車間的窖池中分離到6個屬的酵母,但它們不是同時出現(xiàn),每一個屬的酵母也不是至始至終存在于整個發(fā)酵周期中。入窖時,上層樣中以漢遜酵母為主,另有少量的酒香酵母；中層樣中存在的屬種較豐富,以漢遜酵母、酒香酵母、卵孢酵母為主,也有一定的管囊酵母和德克酵母。發(fā)酵7天的樣中酵母種屬的豐度大大下降,主要以固囊酵母為主,只有少量的德克酵母和卵孢酵母。發(fā)酵14天的樣中檢測到的酵母較少,只有一定的漢遜酵母和德克酵母。發(fā)酵21天的樣品種中只檢測到了固囊酵母這一種優(yōu)勢菌群。發(fā)酵28天的樣品中有少量的卵孢酵母、德克酵母和管囊酵母。發(fā)酵49天的樣品中分離到少量的固囊酵母和德克酵母。3.2北車間窖池1在北車間窖池1中,先后檢測到了德巴利酵母<Debaryomyces>、假絲酵母<Candida>、畢赤酵母<Pichia>和漢遜酵母<Hansenula>。它們在整個發(fā)酵過程時間上的分布,以及在整個窖池空間中的分布情況分述如下。德巴利酵母屬<Debaryomyces>德巴利酵母在北車間窖池1中存在較廣,在總菌數(shù)種占有很大的比例,并且其消長趨勢與總的酵母菌基本一致。但是在發(fā)酵7天的樣品中卻沒有檢測到,從它的消長情況來看不應(yīng)該出現(xiàn)這種現(xiàn)象,分析可能是在檢測過稃中出現(xiàn)了錯誤。結(jié)果見表3-7所示。假絲酵母屬<Candida>假絲酵母在整個發(fā)酵過程在也是大量存在。但是與總菌數(shù)之間沒有明顯契合的滑長走勢,從入窖到發(fā)酵7天急劇增值,14天有所下降,而在上層中21天又達到一個商峰。在發(fā)酵后期,假絲酵母在整個窖池都是以非常少的數(shù)量存在,出窖樣中基本檢測不到。結(jié)果見表3-8所示。畢赤酵母屬<Pichia>畢赤酵母主要在發(fā)酵的第14天被檢測到,且數(shù)量較大。特別是在上層邊樣和中層中樣中占有非常高的比例,表明畢赤酵母在發(fā)酵14天左右是北車間窖池1中的優(yōu)勢菌群。但是從發(fā)酵21天及以后的取樣中都沒有檢測到畢赤酵母。結(jié)果見表3-9所示。漢遜酵母屬<Hansenula>漢遜酵母也主要在發(fā)酵的第14天檢測到,但數(shù)量上遠不及畢赤酵母。另外,發(fā)酵28天的樣品中也有一定的存在,其余時間上基本沒有檢出。結(jié)果見表3-10所示。北車間窖池l酵母優(yōu)勢菌群概述在北車間窖池l中只分離到4個屬的酵母,豐度上略低于南車間窖池和北車間窖池2,但仍然足在不同的發(fā)酵時期以不同的酵母占主導(dǎo)地位。入窖樣特別是中層樣中德巴利酵母占據(jù)了絕對的優(yōu)勢地位,在上層樣中還有一部分假絲酵母。發(fā)酵7天的樣中基本只分離到大量的假絲酵母,其它的酵母都沒檢測到。發(fā)酵14天的樣品中分離到的種群較豐富,以德巴利酵母為主,其它3種酵母的檢出也較多。發(fā)酵21天的樣品中假絲酵母最多,德巴利酵母次之,其它兩種沒有檢測到。發(fā)酵28天才樣品中則是漢遜酵母最多,德巴利酵母次之,并有少量的假絲酵母。發(fā)酵49天的樣品中只分離到少量的德巴利酵母和假絲酵母。3.3北車間窖池2在北車間窖池2中,先后檢測到了德巴利酵母<Debaryomyces>、假絲酵母<Candida>、畢赤酵母<Pichia>、酵母屬酵母<Saccharomyces>、伊薩酵母<1ssatchenkia>和紅酵母<Rhodotorula>。它們在整個發(fā)酵過程時間上的分布,以及在整個窖池空間中的分布情況分述如下。德巴利酵母屬<Debaryomyces>與北車間窖池1中的情況相似,德巴利酵母在北車間窖池2中也是廣泛的存在,在總菌數(shù)中占有很大的比例,其消長趨勢也與總的酵母菌消長情況基本一致,而且在發(fā)酵7天的樣品中也只檢測到少量的存在。結(jié)果見表3-ll所示。假絲酵母屬<Candida>北車間窖池2中的假縫酵母也比較多,特別在發(fā)酵7天和14天的樣品中被大量的檢測到。其消長情況也與所有酵母總的趨勢一致,在第7天達到高峰后隨發(fā)酵時間的推移而逐漸減少,到發(fā)酵后期基本沒有被檢出。其結(jié)果見表3-12所示。畢赤酵母屬<Pichia>畢赤酵母主要出現(xiàn)在發(fā)酵的第7天和14天樣中,并且主要集中在上層樣品中,中層和下層只有少量的存在。從發(fā)酵的21天至出窖這段發(fā)酵期間都沒檢測到畢赤酵母的存在。結(jié)果見表3-13所示。酵母屬<Saccharomyces>酵母屬酵母主要出現(xiàn)在發(fā)酵14天和發(fā)酵28天的樣品中,在入窖的上層樣和發(fā)酵21天的上層樣中也有所檢出。發(fā)酵49天和出窖的樣品中完全沒有檢測到酵母屬酵母的存在。結(jié)果見表3-14所示。伊薩酵母屬<1ssatchenkia>與前幾類酵母相比,伊薩酵母的數(shù)量較少,主要存在于發(fā)酵發(fā)酵7天和14天的上層、中層樣中。從發(fā)酵21天到出窖部完全沒有被檢測到,另外下層樣中也至始至終沒有被檢測到。結(jié)果見表3-15所示。紅酵母屬<Rhodotorula>紅酵母的情況比較特別,在其它時間都沒有被檢測到,卻出現(xiàn)在整個發(fā)酵過程已完成的出窖中層樣品中。結(jié)果見表3-16所示。北車間窖池2酵母優(yōu)勢菌群概述在北車間窖池2中分離到了6個屬的酵母,在種屬多樣性上與南車間窖池相當(dāng),而且不同的發(fā)酵時期仍然以不同的酵母為優(yōu)勢種群。入窖樣中,德巴利酵母是絕對優(yōu)勢菌,其它屬的酵母都以極其微小的比例存在,甚至不能被檢測到。發(fā)酵7天的樣品中,假絲酵母取代了德巴利酵母的地位成為新的絕對優(yōu)勢菌,其它屬的酵母檢出較少。發(fā)酵14天的樣品中德巴利酵母的數(shù)量又急劇增加,在數(shù)量上再次占據(jù)首要地位,其次是假絲酵母,然后是畢赤酵母和酵母屬,伊薩酵母只有極少量存在。發(fā)酵21天的樣品中,主要存在的也是德巴利酵母和假絲酵母,其他的數(shù)量甚微。發(fā)酵28天的樣品中酵母屬酵母最多,其次是德巴利酵母。發(fā)酵49天的樣品中總菌數(shù)已經(jīng)很少了,還是以德巴利酵母為主。4三個窖池的比較由于所處地域的氣候狀況、土壤條件、水質(zhì)優(yōu)劣等環(huán)境的不同,以及發(fā)酵工藝和技術(shù)的差異,必然在窖池的發(fā)酵過程中出現(xiàn)不同的優(yōu)勢菌群,以及數(shù)量上的差異。也正因為如此,不同的環(huán)境和工藝技術(shù)會生產(chǎn)出不同風(fēng)味和品質(zhì)的酒來。窖池所處的環(huán)境又有大小之分,比如盆地這個降水最大,平均氣溫較低的亞熱帶生物氣候區(qū)就是孕育了眾多高品質(zhì)濃香型白酒的良好大環(huán)境；然而川酒雖以濃香型為主,卻各有各的獨特風(fēng)味,除了釀造工藝的差異這個原因以外,就要歸因于小環(huán)境的異同了。因此我們選取了我廠南、北區(qū)域兩個車間的窖池進行分析,并在同一個地方選取了兩個發(fā)酵工藝稍有不同的窖池進行比較。首先從數(shù)量上看,北車間兩個窖池的酵母菌數(shù)遠遠多于南車間的數(shù)量<北車間窖池的總菌數(shù)基本上比南車間高兩個數(shù)量級>,而北車間兩個窖池之間在總菌數(shù)上卻沒有較大差異。從消長情況來看,南車間窖池中發(fā)酵到7天左右就完成了酵母的增殖過程,總菌數(shù)達到了最高峰；在北車間窖池1中,發(fā)酵到14天和21天左右酵母才增殖完畢；在北車間窖池2中一開始就接種了大量的菌種,整個發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)從入窖到出窖完全是一個逐漸減少的過程。從優(yōu)勢菌群來看,每個窖池都有4～6個屬的酵母優(yōu)勢菌群,但是各個窖池中分布的優(yōu)勢菌又有所差異。南車間窖池中以漢遜酵母、酒香酵母、固囊酵母、卵孢酵母、德克酵母和管囊酵母為主；北車間窖池1中以德巴利酵母、假絲酵母、畢赤酵母和漢遜酵母為主,且德巴利酵母和假絲酵母在發(fā)酵的某些時段成為唯一的絕對優(yōu)勢菌；北車間窖池2中以德巴利酵母、假絲酵母、畢赤酵母、酵母屬酵母、伊薩酵母和紅酵母為主,與北車間窖池I相似,德巴利酵母和假絲酵母也在某些時段成為唯一的絕對優(yōu)勢菌。參考文獻:[1]仲幾曉.白酒行業(yè)分析[J].釀酒,29<4>:8.[2]郭來虎.中國第一窖[M].中國工人,1999,28-29.[3]林曉民.真菌rDNA的特點及在外生菌根菌鑒定中的應(yīng)用[J],西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2005,<2>:120-125.[4]萍,秀容,廣武等.微生物學(xué)實驗,高等教育[M],1999.[5]文學(xué),春莉,等.耐酸性a-淀粉酶的分離純化[J],大學(xué)學(xué)報<工學(xué)版>,2002<2>:51-56.[6]周德慶.微生物學(xué)試驗手冊,科學(xué)技術(shù)[M],1986.[7]紀忠.微生物分類學(xué)[M],:復(fù)日大學(xué),1992.[8]中國科學(xué)院微生物研究所《常見與常用真菌》編寫組:常見與常用真菌,科學(xué),1973.[9]施立明,賈旭,胡成昂.遺傳多樣性[A].<1993>.見:靈芝主編:中國的生物多樣性一現(xiàn)狀及其對策[C].:科學(xué),99-113.[10]F.奧斯伯,精編分子生物學(xué)實驗指南[M]